火龍果莖植物甾醇對姜黃素納米脂質體穩定性以及釋放性能的影響

黎雨浩，李照瑩，周 偉,,*，付調坤，鄒立強，彭盛峰，成 策，劉 偉

（1.南昌大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，農業農村部熱帶作物產品加工重點實驗室，廣東 湛江 524001）

姜黃素是一種從姜黃中提取的疏水性多酚，現代醫學表明，它具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗血栓等多種保健功能[1]。由于其水溶性低、在胃腸液環境中穩定性差等缺點，導致其口服生物利用度極低[2]，嚴重限制了姜黃素在食品和制藥工業中的應用。為了提高姜黃素在水中的溶解度、穩定性以及生物利用度，目前研究中主要采用脂質體、乳液、膠束、納米粒子等多種載體負載姜黃素。從而改善其理化穩定性和生物可接受率[3]。

脂質體是由磷脂分子在水相中自組裝形成的雙親性雙層膜球形小泡，由內核水相和磷脂雙分子層構成。脂質體的雙親性使其可運載多種親水性或疏水性的營養分子，從而提高其穩定性和生物可利用率[4-7]。作為一種研究廣泛的運載體系，脂質體在藥學、化妝品和保健食品等不同領域具有非常大的應用潛力。研究表明，脂質體負載姜黃素可有效提高其水溶性和理化穩定性，從而改善姜黃素在體內外消化過程中的接受率[8]。脂質體具有諸多優勢，如生物相容性、無毒性、生物降解性等[9-10]。然而脂質體也有許多缺陷，如在加工、運輸和儲存過程中容易發生聚集，導致藥物泄漏，且其自身穩定性較差，容易受到外界環境的影響，如溫度、鹽離子以及復雜pH值環境等[11-12]。近年來，研究者對提高脂質體的穩定性進行大量研究，如Pu Chuanfen等[13]研究表明瓜爾膠能提高姜黃素脂質體的穩定性。Tai Kedong等[14]發現添加β-谷甾醇可以提高姜黃素脂質體的穩定性以及生物利用度。Li Ziling等[15]發現采用普朗尼克修飾姜黃素脂質體，可以提高其pH值穩定性和熱穩定性。Tian Meiping等[16]采用殼聚糖修飾脂質體以改善姜黃素的口服遞送能力。

在傳統脂質體的制備過程中，通常會添加一定比例的膽固醇以調節膜的流動性，提高磷脂雙分子層的穩定性[17-20]。但膽固醇的存在會增加人體冠心病、動脈粥樣硬化等疾病的風險。尋找膽固醇的合適替代物優化傳統脂質體的配方對于擴大脂質體在食品和醫藥領域的應用具有重要意義。植物甾醇是一類重要的植物天然活性物質，它可以抑制生物體對膽固醇的吸收，影響膽固醇在人體內的代謝，抑制膽固醇的生物合成，從而降低心血管疾病的患病概率，此外植物甾醇具有抗炎、抗癌、抗氧化等多種功能[21]。用植物甾醇代替膽固醇作為構建脂質體的主要膜材料，即可避免膽固醇過多攝入的副作用，還能改善脂質體膜的特性，大大提高植物甾醇本身的生物活性[22]。

目前對于植物甾醇脂質體的研究較少，特別是使用PSP代替膽固醇制備脂質體以運載生物活性物質的研究鮮有報道。本實驗考察PSP代替膽固醇對姜黃素納米脂質體（curcumin-nanoliposomes，NLs-Cur）穩定性以及姜黃素體外釋放性能的影響，結果表明PSP可顯著提高NLs-Cur的穩定性，且有更好的緩釋效果。本實驗研究PSP代替膽固醇制備新型脂質體運載生物活性物質，以期為獲得更好穩定性和緩釋性的脂質體提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PSP由中國熱帶農業科學院農產品加工研究所采用超聲輔助提取法制備[24-25]，純度達91.2%；姜黃素（純度98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷脂S75（大豆卵磷脂含磷脂酰膽堿71%和磷脂酰乙醇胺10%）德國Lipoid公司；1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（1,6-diphenylhexa-1,3,5-triene，DPH） 美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

M-700微射流儀 美國Microfluidics公司；RE52-05旋轉蒸發儀 上海亞榮公司；T-6紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；FZ7000熒光光譜儀 日本日立高新技術公司；Zetasizer Nano ZSP 英國Malvern公司；LUMiFuge穩定性分析儀 德國LUM公司。

1.3 方法

1.3.1 火龍果莖植物甾醇姜黃素納米脂質體（curcuminphytosterol nanoliposomes，PNLs-Cur）的制備

參照前期研究方法[26]，采用薄膜分散法結合動態高壓微 射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）法制備火龍果莖PNLs-Cur。將磷脂、植物甾醇、姜黃素溶于無水乙醇中，待完全溶解后，轉移至圓底燒瓶，于真空條件下旋轉蒸發除去乙醇形成薄膜，隨即用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，5 mmol/L，pH 7.0）洗膜獲得粗脂質體懸濁液，80 MPa微射流下處理2 次。最終得到的脂質體懸濁液中磷脂質量濃度為10 mg/mL，姜黃素質量濃度為0.4 mg/mL以及磷脂與PSP不同的質量比（10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1）。以不添加PSP的NLs-Cur作為實驗空白。

1.3.2 火龍果莖PNLs-Cur理化性質表征

1.3.2.1 粒徑與Zeta電位測定

樣品用PBS（pH 7.0，5 mmol/L）稀釋10 倍，采用Zetasizer Nano ZSP測定平均粒徑、多分散系數（polydispersity index，PDI）以及Zeta電位。樣品測定前于25 ℃平衡2 min。

該項指標的使用方式是每個經營年度以全組中考勤最低分作為組內所有人在本經營年度的考勤得分，采用集體利益掛鉤個人利益的方式進行考評。旨在以集體榮譽感督促、保障全員參與到課程中來，同時讓學生充分理解系統論中個體與系統的關系。

1.3.2.2 膜流動性的測定

參考Peng Shengfeng等[27]的測定方法并稍作修改。用DMSO配制2×10―3mol/L的DPH溶液。采用PBS（pH 7.0，5 mmol/L）將200 μL的脂質體懸浮液與5 μL DPH溶液稀釋到5 mL，在25 ℃孵育30 min，孵育完成后于激發波長360 nm、發射波長430 nm的條件下測定熒光強度。脂質體的熒光各向異性（P）由下式計算：

式中：I0,0和I0,90分別為發射光平行于激發光和垂直于激發光的熒光強度；G為光柵校正系數。

由于各向異性與流動性呈反比，所以膜流動性表示為1/P。

1.3.2.3 PNLs-Cur的穩定性分析

參考Tai Kedong等[28]的方法并稍作修改。采用穩定性分析儀測定不同環境條件下PNLs-Cur穩定性。將制備好的樣品振蕩均勻，倒入樣品槽中。測定參數為25 ℃、1 h、掃描間隔10 s、轉速4 000 r/min。

新鮮制備的火龍果莖PNLs-Cur以及NLs-Cur，分別調節pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0后靜置1 d，再經高速分散均勻后，測定其穩定性。并用相應pH值的去離子水稀釋脂質體5 倍，測定其粒徑以及Zeta電位。

新鮮制備的火龍果莖PNLs-Cur以及NLs-Cur，分別調節離子濃度至50、100、200、400 mmol/L后靜置1 d，再經高速分散均勻后，測定其穩定性。并用相同濃度NaCl溶液稀釋脂質體5 倍，測定其粒徑以及Zeta電位。

1.3.3 熱穩定性

參考Peng Shengfeng等[29]方法并稍作修改。通過測定姜黃素在80 ℃的降解速率評估其在脂質體懸浮液中的熱穩定性。負載姜黃素的脂質體以體積比1∶4加入PBS（pH 7.0，5 mmol/L）中，以2 mL離心管分裝（每個離心管1 mL樣品），然后將離心管置于80 ℃的水浴中，并以加入適量吐溫80的姜黃素水溶液作為對照。在預定的時間間隔（0、10、20、30、40、50 min和60 min）中取出離心管并將其置于冰水中冷卻，最后在420 nm波長處測定姜黃素吸光度，根據姜黃素標準曲線計算姜黃素的含量。姜黃素標準曲線為y=6.836x+0.029 8，R2=0.999 8，線性范圍為0.2～5 μg/mL。

1.3.4 體外釋放

參考Chen Xing等[30]的測定方法并稍作修改。對2 種脂質體釋放性能進行評估。取2 mL PNLs-Cur或NLs-Cur懸濁液各3 份，置于透析袋中，將透析袋封口置于50 mL的PBS（含0.5%吐溫80、10%乙醇，pH 7.0）的溶出介質中。水浴溫度為37 ℃，于固定的時間間隔（0.5、1、2、4、8、12、24、48、72 h）各取樣2 mL，同時補加2 mL溶出介質于420 nm波長處測定姜黃素的含量。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 磷脂與PSP質量比對火龍果莖PNLs-Cur的影響

表1 不同質量比火龍果莖PNLs-Cur的粒徑、Zeta電位以及PDITable 1 Particle size, zeta potential and PDI of curcuminnanoliposomes with different contents of pitaya stem phytosterol

脂質體的穩定性通常受其粒徑與Zeta電位影響，研究表明，脂質體粒徑越小、電位絕對值越高，脂質體越穩定[31-32]。如表1所示，磷脂與PSP質量比10∶1和8∶1制備PNLs-Cur的平均粒徑分別為（81.99±1. 78）nm和（83.76±1.29）nm，均大于NLs-Cur的平均粒徑（64.81±1.25）nm，而質量比為6∶ 1、4∶1與2∶1的PNLs-Cur粒徑顯著（P＜0.05）增大，并且PDI也顯著增加（P＜0.05），植物甾醇作為一類有益的生理活性成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化等生理功能，在保持脂質體較小尺寸及較佳穩定性，選定質量比8∶1制備PNLs-Cur。這可能是因為較少量植物甾醇更有助于形成穩定的脂質體結構，而較高的植物甾醇摻入量插入導致空間增大。楊貝貝等[33]研究不同含量的大豆植物甾醇含量對脂質體粒徑的影響，發現隨著大豆植物甾醇含量的增加，脂質體的粒徑逐漸增大。趙航[34]研究不同含量的混合植物甾醇、β-谷甾醇及豆甾醇對脂質體粒徑的影響，發現隨著植物甾醇的含量增加，脂質體的粒徑隨著增大。這與本實驗結果一致。后續選擇質量比為8∶1分析火龍果莖PNLs-Cur的穩定性因素。

結果表明，所有PNLs-Cur或NLs-Cur間電位都相差不大，說明PSP的摻入對其電位無顯著影響。這是由于甾醇缺乏電荷，脂質體的Zeta電位大小主要由卵磷脂決定[28]。

2.2 膜流動性

膜流動性大，脂質體的穩定性差，藥物釋放越快[35]，降低膜流動性可以顯著提高脂質體的穩定性和緩釋性。Mora等[36]研究發現，將甾醇加入膜中可以促進甾醇的側鏈與磷脂?；湹氖杷饔煤头兜氯A力。Bui等[37]發現加入膽固醇、羊毛甾醇或其衍生物均可以降低膜流動性，且可改善膜的硬度。Tai Kedong等[14]發現加入β-谷甾醇均可降低膜流動性，但是磷脂與β-谷甾醇的比例為2∶1時卻沒有降低膜流動性的效果。

PNLs-Cur與NLs-Cur的膜流動性值（1/P）分別為7.06±0.01與10.06±1.14?？梢钥闯黾尤隤NLs-Cur的膜流動性相比于NLs-Cur顯著（P＜0.05）降低，這說明加入PSP的脂質體形成了更加致密 的雙層膜，這與其他學者的結果一致[37]。

2.3 pH值穩定性

表2 pH值對PNLs-Cur的粒徑、表面電荷的影響Table 2 Effect of pH on the surface charge and average particle size of PNLs-Cur

表3 pH值對NLs-Cur的粒徑、表面電荷的影響Table 3 Effect of pH on the surface charge and average particle size of NLs-Cur

由表2、3可以看出，脂質體的表面電荷在pH 2時為正，pH 3時為負，磷脂S75的表面電荷在pH 2～3之間變為零，這與Peng Shengfeng等[27]發現一致。經1 d貯藏后，PNLs-Cur與NLs-Cur在pH 3以及pH 4粒徑都有顯著增大，并且PDI顯著增加，這可能是由于單一磷脂S75制備的姜黃素納米脂質體在pH 3以及pH 4的時候聚集，相互之間融合。

圖1 NLs-Cur與PNLs-Cur在不同pH值條件下的透光率曲線Fig. 1 Transmission pro files of NLs-Cur and PNLs-Cur at different pH conditions measured by LUMiFuge

圖2 不同pH值條件下NLs-Cur（A）與PNLs-Cur（B）的不穩定性指數Fig. 2 Instability index curves of NLs-Cur (A) and PNLs-Cur (B)under different pH conditions obtained by software of LUMiFuge

通過LUMiFuge儀器軟件可以獲得一系列時間與空間相關的投射曲線。紅色曲線表示較早的掃描曲線，綠色為較晚的掃描曲線，曲線變化是由于脂質體在離心條件下相互聚集沉積在樣品槽底部，從而導致樣品槽不同部位的透光率發生變化[38]。由圖1可知，在相同pH值條件下，NLs-Cur的遷移快于PNLs-Cur。通過不穩定性指數曲線分析（圖2），可更好地說明在離心條件下PNLs-Cur以及NLs-Cur穩定性差異[38]，這表明在相同pH值條件下PNLs-Cur的不穩定性指數均小于NLs-Cur。這是可能是因為PSP的存在使得脂質體的膜結構變得更加穩定。

2.4 離子穩定性

表4 離子強度對PNLs-Cur粒徑、表面電荷的影響Table 4 Effect of the ionic strength on the surface charge and average particle size of PNLs-Cur

表5 離子強度對NLs-Cur粒徑、表面電荷的影響Table 5 Effect of ionic strength on the surface charge and average particle size of NLs-Cur

由表4、5可知，隨著NaCl濃度的增加，脂質體的Zeta電位絕對值均相應減小，這可能是因為NaCl的靜電屏蔽作用[39]。Peng Shengfeng等[27]的研究發現，磷脂S75構建的脂質體在不同的NaCl濃度下的粒徑變化不大，這與本實驗結果一致。且發現隨著NaCl濃度上升，脂質體的平均粒徑會呈先略微上升再下降的趨勢，這可能是因為脂質體膜上的離子梯度導致水分從其內部流出[39-40]。

圖3 NLs-Cur與PNLs-Cur在不同離子強度條件下的透光率曲線Fig. 3 Transmission pro files of NLs-Cur and PNLs-Cur under different ionic strength conditions measured by LUMiFuge

由圖3、4可知，在0～200 mmol/L的NaCl濃度之間，PNLs-Cur的穩定性顯著優于NLs-Cur，不穩定性指數可以得出，PNLs-Cur不穩定性指數均小于NLs-Cur，說明PNLs-Cur在相同離子濃度條件下的穩定性好于NLs-Cur。

圖4 NLs-Cur（A）與PNLs-Cur（B）在不同離子強度條件下的不穩定性指數Fig. 4 Instability index curves of NLs-Cur (A) and PNLs-Cur (B)under different ionic strength conditions obtained by software of LUMiFuge

2.5 熱穩定性實驗結果

圖5 PNLs-Cur與NLs-Cur在80 ℃姜黃素的降解率Fig. 5 Degradation rates of curcumin in PNLs-Cur and NLs-Cur at 80 ℃ within 60 min

脂質體的熱穩定性是評價其在加工和應用過程中的一個重要指標，因此評價了PSP對NLs-Cur熱穩定性的影響[15]。如圖5所示，在80 ℃的處理下，前10 min姜黃素的降解較快，PNLs-Cur與NLs-Cur分別下降了17.61%和21.4%，而此后姜黃素降解逐漸變緩，這與Li Ziling等[15]的研究結論一致。姜黃素在PBS中降解速率非?？?，前10 min已經降解46.1%。處理60 min后，PNLs-Cur和NLs-Cur的姜黃素保留率分別為61.25%和57.48%，而姜黃素溶液保留率顯著（P＜0.05）低于P NLs-Cur與NLs-Cur，僅為17.21%。證明將姜黃素包埋在脂質體中可以有效提高其熱穩定性，這與Tai Kedong等[14]的研究結論一致。比較PNLs-Cur和NLs-Cur對保留率，說明PSP的存在顯著（P＜0.05）延長了姜黃素在高溫條件下的降解數量，PNLs-Cur表現出更好的熱穩定性。

2.6 體外釋放實驗結果

圖6 NLs-Cur和PNLs-Cur 的體外釋放曲線Fig. 6 In vitro release curves of NLs-Cur and PNLs-Cur

通過對NLs-Cur體外釋放行為的研究對其體內性能具有重要的意義，有助于評價姜黃素的緩釋行為[15]。如圖6所示，NLs-Cur與PNLs-Cur初始釋放較快，隨后釋放減緩，這與Yingyuad等[41]研究結果相似。PNLs-Cur在72 h的累計釋放率為50.08%，而NLs-Cur為63.64%。Kaddah等[42]發現，加入膽固醇后，羅丹明B的釋放量顯著下降。Tai Kedong等[14]報道了添加β-谷甾醇顯著降低了姜黃素在納米脂質體中的累計釋放速率，并且隨著β-谷甾醇的增加，累計釋放速率隨之降低。這說明PSP的存在可以顯著（P＜0.05）減緩NLs-Cur的釋放速率，其原因可能是PSP與磷脂的相互作用使得脂質體的雙層膜更加致密，從而降低姜黃素的滲透率。

3 結 論

本實驗利用PSP替代膽固醇修飾NLs-Cur，以提高其理化穩定性和姜黃素的緩釋性。通過對粒徑、電位等指標的考察，發現PSP可使NLs-Cur粒徑顯著增大，當磷脂與PSP的比例為8∶1時，其制備PNLs-Cur的平均粒徑為（83.76±1.29）nm，Zeta電位為（－11.0±1.06）mV，PDI為0.30±0.002，各項指標較為理想；穩定性實驗表明，相同條件下發現PNLs-Cur的不穩定性指數更小，即PSP可改善NLs-Cur的離子和pH值穩定性。此外，PNLs-Cur具有更好的熱穩定性，80 ℃處理60 min后姜黃素的保留率更高。體外釋放結果表明，PSP可以顯著提高NLs-Cur的緩釋特性。因此，本研究可為采用PSP代替膽固醇，制備更 加穩定的無膽固醇脂質體載體提供一定的理論指導，對火龍果莖副產物的綜合利用具有一定的應用啟發。