黑曲霉固態發酵對甘蔗葉酚類物質釋放及抗氧化活性的影響

閻欲曉，粟桂嬌，何勇強

（廣西大學生命科學與技術學院，廣西 南寧 530004）

植物多酚是植物中具有多個酚羥基結構的化合物的總稱，通常分為可溶性多酚與不可溶性-結合態多酚，其中可溶性多酚易于用有機溶劑直接提取，結合態多酚類通常與植物細胞壁中的纖維素、蛋白質、木質素、糖基、有機酸結合成共價復合物而難以提取[1-4]。

近年來，微生物固態發酵技術逐漸應用于植物酚類物質提取研究中，通過微生物發酵產生的復合酶系（纖維素水解酶、木質素水解酶和果膠水解酶等）的水解作用，破壞細胞壁纖維成分的致密結構或者切除多酚物質與其他物質之間交聯的共價鍵，從而促進酚類物質的釋放和轉化，進而影響其生物活性的變化[5]。有學者利用黑曲霉和少孢根霉固態發酵果汁加工后副產品果渣，發酵后果渣中多酚、黃酮的含量有較大增加，自由基清除活性顯著上升[6-7]。Bei Qi等[8]研究表明，燕麥經紅曲固態發酵后，游離型和共軛型酚類物質的含量顯著增加，并且有效提升了燕麥的生物活性。Saharan等[9]利用真菌對5 種谷物原料進行固態發酵，發酵后谷物酚類物質含量的增加與發酵過程中的木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶酶活性呈顯著相關；Wang Lu等[10-11]研究發現，使用混合真菌發酵番石榴葉后其總酚和槲皮素含量比發酵前增加了2.06 倍和3.02 倍，發酵過程中產生的總纖維素酶活力、木聚糖酶活力與α-淀粉酶活力相對較高，能有效切除番石榴多酚與細胞壁上纖維素、半纖維素、多糖組分之間的化學鍵，釋放出更多的可溶性多酚。

甘蔗葉是甘蔗制糖產業中主要的副產品，產量非常大。研究表明，甘蔗葉中含有一定量的酚類物質，主要是黃酮[12-14]、酚酸類[15-16]，在不同甘蔗品種（系）葉片中含量差異較大[17]，大致在0.5%～2%范圍內[17]，具有抗氧化[18]、抗突變[19]、抗炎[20]、降血糖[21]等生理功能。但甘蔗葉中大部分酚酸都以結合態的形式存在[22]，為更有效提取甘蔗葉中的酚類物質，本研究利用黑曲霉對甘蔗葉進行固態發酵，探討發酵過程對甘蔗葉中多酚、黃酮的釋放及抗氧化性能的影響，旨在為甘蔗葉的深度開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗葉，采摘自廣西大學農學院試驗田，取甘蔗莖頂上嫩節及青綠色葉片，自然干燥后粉碎過20 目篩；黑曲霉GXU003，廣西大學生命科學與技術學院實驗室分離保藏；斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基；種子培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值，水1 000 mL。

福林-酚（分析純） 北京普博欣生物科技有限責任公司；蘆丁標準品（分析純） 生工生物工程（上海）有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenylβ-D-glucopyranoside，p-NPG）（均為分析純） 美國Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

超聲波破碎儀 美國SONIC & MATERKALS公司；3-18K高速冷凍離心機 德國Sigma公司；全自動酶標儀Elx80 美國BioTek Instruments公司；UVmini-1240紫外分光光度計 島津企業管理（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉種子液的制備

取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上培養的黑曲霉斜面2 支，在無菌條件下，各用5 mL無菌水洗下孢子液，將黑曲霉菌懸液全部接種到50 mL的種子培養液中，在30 ℃、180 r/min條件下培養8 h。

1.3.2 甘蔗葉培養基制備

稱取3.5 g甘蔗葉于250 mL的三角瓶中，加入1 g麩皮及1 g豆粕，調節培養基含水量，于121 ℃滅菌20 min，冷卻后備用。

1.3.3 甘蔗葉固態發酵單因素試驗

接種量的選擇：分別以7、14、21、28、35 mL/100 g的接種量將黑曲霉種子液接入甘蔗葉固態發酵培養基，培養基含水量為60%，30 ℃培養3 d。每天手動搖瓶2 次，發酵結束后，產品置于60 ℃的烘箱中烘干，保存于干燥器中。以未接菌的甘蔗葉培養基為對照組。

培養基含水量的選擇：控制培養基的初始含水量分別為40%、50%、60%、70%，按28 mL/100 g接種量將黑曲霉種子接入不同含水量培養基中，30 ℃培養3 d。

發酵時間的選擇：以28 mL/100 g的接種量接入黑曲霉，控制培養基的初始含水量60%，在30 ℃恒溫培養箱中培養2、3、4、5、6 d。

1.3.4 甘蔗葉固態發酵正交試驗設計

以發酵基質中黃酮和多酚含量為綜合指標，選取接種量、培養基含水量和發酵時間，進行L9（34）3因素3水平正交試驗，試驗設計與結果見表1。

表1 L9（334）正交試驗因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used in orthogonal array desiiggnn

1.3.5 甘蔗葉發酵產物中多酚、黃酮含量測定

1.3.5.1 活性成分的提取

取一定量的發酵和未發酵產品，以料液比1∶20（g/mL）加入60%乙醇溶液，在功率為300 W條件下超聲提取35 min，超聲結束后抽濾，收集濾液進行黃酮和多酚含量測定。

1.3.5.2 多酚含量測定

按照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》進行測定。根據沒食子酸標準曲線回歸方程y=11.425x+0.024 9（R2=0.999 8），計算樣品中多酚含量。總酚含量表示為沒食子酸干基當量（mg/g）。

1.3.5.3 黃酮含量測定

使用硝酸鋁絡合分光光度法測定總黃酮含量[23]。按照蘆丁標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量，具體為：y=11.831x－0.038 4（R2=0.999 6）。黃酮含量表示為蘆丁干基當量（mg/g）。

1.3.6 發酵過程中酶活力測定

1.3.6.1 粗酶液的提取

取一定量的研磨后的發酵產物，按料水比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，置于120 r/min、40 ℃恒溫搖床1 h，隨后4 ℃、8 000 r/min離心10 min取上清液，即為粗酶液。

1.3.6.2 纖維素酶（羧甲基纖維素酶）活力測定

參照郝建宇等[24]的方法，略作修改。在20 mL刻度試管中加入粗酶液0.5 mL和羧甲基纖維素鈉懸浮液（0.05 mol/L檸檬酸緩沖液配制）1 mL，50 ℃水浴30 min后，立即加入3 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑，沸水浴5 min。冷卻后定容到20 mL，于540 nm波長處測定吸光度。根據葡萄糖標準方程計算葡萄糖質量（以加入滅活0.5 mL粗酶液為空白對照）。1 g發酵基質（干質量），在酶最適反應條件下，每小時分解纖維素產生1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為1 個酶活力單位，用U/g表示。

1.3.6.3 β-葡萄糖苷酶活力測定

取160 μL的緩沖液和20 μL 20 mmol/L的p-NPG溶液混勻后，30 ℃預熱2 min，加入20 μL的粗酶液，反應20 min，加入50 μL 2 mol/L Na2CO3溶液終止酶反應，測定OD405nm。采用p-NP為標準品繪制標準曲線（以加入20 μL已失活的酶液作為空白對照）。1 g發酵基質（干質量），在酶最適反應條件下，每小時水解p-NPG釋放1 μmol p-NP所需的酶量定義為1 個酶活力單位，用U/g表示。1.3.7 羥自由基清除率測定

參照郭麗等[25]的方法，略作修改。試管中依次加入0.75 mmol/L鄰二氮菲-無水乙醇溶液1 mL、0.2 mol/L pH 7.40的磷酸緩沖液2 mL和去離子水1 mL，搖勻后加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻后加入0.01%雙氧水溶液1 mL，37 ℃恒溫水浴60 min，536 nm波長下測定反應體系吸光度AP。1 mL去離子水代替1 mL 0.01%雙氧水溶液，其他操作方法同上，測定其吸光度AB。加入一定濃度樣液1 mL，代替1 mL去離子水，其他操作方法同上，測定其吸光度AS。羥自由基清除率計算如式（1）所示：

1.3.8 DPPH自由基清除測定

參照陳樹俊等[26]的方法，略作修改。取一定濃度的發酵產物待測樣液2 mL，加入0.3 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL，搖勻后避光放置30 min，517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率計算如式（2）所示：

式中：A為DPPH溶液吸光度；As為DPPH混合樣液的吸光度；Ar為樣液+60%乙醇溶液的吸光度。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 接種量對發酵甘蔗葉多酚、黃酮含量的影響

圖1 接種量對黃酮（A）和多酚（B）含量的影響Fig. 1 Effect of inoculum volume on the release of flavonoids (A) and polyphenols (B)

從圖1可以看出，經不同接種量的黑曲霉發酵處理3 d后，發酵甘蔗葉中黃酮和多酚的釋放量均顯著高于對照組（P＜0.05）。在接種量為7～28 mL/100 g的范圍內，黃酮和多酚含量隨接種量的增加而提高，當接種量為28 mL/100 g時黃酮和多酚釋放量均達到最高，分別為9.65 mg/g和9.47 mg/g，而接種量增加至35 mL/100 g時，黃酮和多酚的釋放量反而有所下降。原因可能是當接種量過大時，培養基中營養物質不能滿足菌體生長需要，一些酚類化合物被微生物當作碳源利用[27]。

2.1.2 培養基含水量對發酵甘蔗葉多酚、黃酮含量的影響

圖2 培養基含水量對黃酮（A）和多酚（B）含量的影響Fig. 2 Effect of initial water content of culture medium on the release of flavonoids (A) and polyphenols (B)

由圖2可知，當培養基含水量為40%時，由于基質中的自由水不足以維持黑曲霉菌體生長所需，進而影響細胞代謝，導致黃酮、多酚的釋放量較低；而含水量達到70%時，培養基出現結塊，傳質困難，也影響了發酵效果。當含水量為50%時黃酮釋放效果最好，達到9.90 mg/g，含水量為60%時多酚含量達到最大，為10.35 mg/g。

2.1.3 發酵時間對發酵甘蔗葉多酚、黃酮含量的影響

圖3 發酵時間對黃酮（A）和多酚（B）含量的影響Fig. 3 Effect of fermentation time on the release of flavonoids (A) and polyphenols (B)

從圖3可以看出，與對照組相比，甘蔗葉經過黑曲霉發酵處理的2～6 d內，黃酮和多酚含量逐漸增高，且均比未發酵對照組有顯著提高（P＜0.05），這是因為固態發酵過程中黑曲霉代謝產生的復合水解酶系的作用，改變了甘蔗葉纖維的致密結構，促進了黃酮和多酚的釋放。其中在第3～5天酚類物質均保持較高含量，變化幅度不大，但第6天后，黃酮和多酚含量則顯著下降（P＜0.05），這可能與在發酵后期產生的水解酶系的活力下降有關，也可能與一些酚類化合物在發酵后期被真菌菌株代謝產生的氧化酶催化氧化成了酚類物質聚合物[28]，或者與酚類化合物被微生物利用有關[27]。Saharan[9]、Wang Lu[10]、Lin Sen[29]等的相關研究也均發現發酵后基質中多酚與黃酮含量在發酵初期增加明顯，發酵成熟期含量保持基本不變，隨后減少的現象。

2.2 正交試驗優化發酵條件

在單因素試驗基礎上，選擇接種量、培養基含水量、發酵時間為正交試驗因素，每個因素3 個水平，正交試驗設計按L9（34）正交表進行。試驗設計及結果見表2。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design with experiment results

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

表3方差分析可知，發酵時間在各個水平上有顯著差異，但培養基含水量和接種量的水平差異不顯著。以黃酮含量為指標，優化后的發酵最佳工藝為接種量28 mL/100 g、培養基含水量60%、發酵時間5 d；以多酚含量為指標，最佳條件為接種量35 mL/100 g、培養基含水量50%、發酵時間4 d。

根據3 個因素的極差大小以及表3方差分析的顯著性差異情況，綜合考慮，選擇接種量28 mL/100 g、培養基含水量50%、發酵時間5 d，測得發酵甘蔗葉中黃酮含量為13.82 mg/g，多酚含量為10.40 mg/g，比未發酵甘蔗葉中可溶性黃酮和多酚含量分別提高了135%和92%（P＜0.05）。

2.3 甘蔗葉發酵過程中相關水解酶活力的變化與酚類物質釋放的關系

2.3.1 發酵過程中水解酶活力的變化

圖4 發酵過程中水解酶活力變化Fig. 4 Changes in the activity of hydrolytic enzymes during fermentation

為闡明甘蔗葉發酵過程中，黑曲霉產生的 相關碳水化合物水解酶與甘蔗葉多酚、黃酮釋放的關系，對發酵過程中產生的纖維素酶活力和β-葡萄糖苷酶活力進行了跟蹤測定，結果如圖4所示。黑曲霉固態發酵過程中能夠產生一定量的纖維素酶和β-葡萄糖苷酶，而且纖維素酶活力明顯比β-葡萄糖苷酶活力高，2 種水解酶活力均呈現先增加后降低的變化趨勢。纖維素酶活力在發酵第4天達到最大值，為632.17 U/g，β-葡萄糖苷酶活力在發酵第5天時達到了頂峰，為75.02 U/g，隨后活力顯著下降。與圖3進行比較可知，發酵過程中產生的水解酶系與酚類物質釋放的變化趨勢基本保持一致，均是在發酵第4～5天，產量達到最大，進一步說明甘蔗葉酚類物質的釋放與微生物發酵過程中產生的水解酶系有密切的關系。

2.3.2 酚類物質釋放量與酶活力變化的相關性分析

為進一步探究黑曲霉發酵甘蔗葉的過程中酚類物質含量與纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活力的關系，分別以黑曲霉發酵后甘蔗葉多酚和黃酮含量為橫坐標，以兩種酶活力為縱坐標，檢驗酚類物質的釋放量與酶活力變化的相關性。

從圖5可知，酚類物質的釋放量與纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活力呈顯著正相關。其中多酚和黃酮含量與纖維素酶活力的相關系數R2分別為0.856 3和0.678 9，與β-葡萄糖苷酶活力的相關系數R2分別為0.510 0和0.622 6，說明酶活力越強，越有利于甘蔗葉中酚類物質的釋放。分析原因，首先纖維素酶破壞甘蔗葉細胞壁纖維素的致密結構，有助于暴露出酚類物質與其他物質之間結合的化學鍵，然后纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等水解酶系斷裂結合態多酚與植物纖維素、半纖維素、木質素以及一些多糖結構連接的共價鍵，釋放出甘蔗葉中結合態酚類物質，從而使可溶性酚類物質含量增加。

圖5 酚類物質含量與纖維素酶、β-葡萄糖苷酶活力的相關性Fig. 5 Correlations between the amount of released phenolics and cellulase and β-glucosidase activity

2.4 抗氧化能力

從圖6可知，在一定質量濃度范圍內，甘蔗葉提取液中黃酮與羥自由基清除率有良好的量效關系，清除率隨黃酮質量濃度的增大而上升。發酵甘蔗葉提取液黃酮質量濃度在200 μg/mL和400 μg/mL時，羥自由基清除率分別為29.61%和91.73%，其IC50值為268.93 μg/mL；而未發酵甘蔗葉黃酮質量濃度在270 μg/mL和450 μg/mL時，羥自由基清除率僅為18.18%和82.78%，IC50值為366.06 μg/mL，說明經過黑曲霉發酵后的甘蔗葉提取液具有較強的羥自由基清除能力，但低于對照組VC（IC50=158.34 μg/mL）。

圖6 發酵甘蔗葉黃酮質量濃度對羥自由基的清除效果Fig. 6 Scavenging effect of flavonoids from fermented sugarcane leaves on hydroxyl radicals

圖7 發酵甘蔗葉黃酮質量濃度對DPPH自由基的清除效果Fig. 7 Scavenging effect of flavonoids from fermented sugarcane leaves on DPPH radical

圖7 顯示，發酵甘蔗葉提取液中黃酮對DPPH自由基清除能力（IC50=21.25 μg/mL）和對照組VC的清除能力差別不大（IC50=20.13 μg/mL），而且明顯強于未發酵甘蔗葉（IC50=39.44 μg/mL），在黃酮質量濃度為40 μg/mL時，發酵甘蔗葉的DPPH自由基清除率達到了79.18%，而未發酵甘蔗葉在黃酮質量濃度為45 μg/mL時，清除率僅為54.01%。

酚類物質抗氧化能力取決于酚類化合物的化學結構、芳香環上的羥基數目、羥基位置以及羥基結構糖基化[30]。已有研究表明，甘蔗葉組織中游離態酚酸對DPPH自由基清除活性優于結合態酚酸[22]。通過微生物發酵過程中產生的復合酶系的水解作用，甘蔗葉中的酚類物質與其他物質（糖類、蛋白質、有機酸）之間的共價作用或非共價作用解除，使甘蔗葉中的酚酸，如沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸、綠原酸、香草酸向游離態轉化，增加了可提取和可利用酚類物質的含量，而這些酚酸已被證實為具有高抗氧化能力[8,31-33]。此外，通過β-葡萄糖苷酶的水解作用，黃酮糖苷分子去糖基化降解為黃酮苷元，研究已證實黃酮苷元清除人體氧自由基的生物活性明顯優于黃酮糖苷[34]。

3 結 論

利用黑曲霉對甘蔗葉進行固態發酵，經60%乙醇溶液提取后，提取液中多酚含量和黃酮含量均比未發酵甘蔗葉樣品顯著上升。在接種量28 mL/100 g、培養基含水量50%、發酵時間5 d條件下，甘蔗葉中黃酮和多酚含量分別為13.82 mg/g和10.40 mg/g，比未發酵甘蔗葉中可溶性黃酮和多酚含量提高了135%和92%（P＜0.05）。

測定發酵過程中微生物代謝產生的纖維素酶活力和β-葡萄糖苷酶活力的變化，發現這2 種水解酶活力均呈現先增加后降低的變化趨勢，而且酶活力的變化趨勢與酚類物質（黃酮、多酚）含量的變化趨勢基本一致；通過相關性分析可知，發酵過程中酚類物質的釋放量與纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活力呈良好正相關，說明甘蔗葉酚類物質的釋放與微生物發酵過程中產生的水解酶系有密切關系。

發酵前后的甘蔗葉黃酮提取液均對自由基具有一定的清除能力，但發酵后甘蔗葉黃酮提取液對DPPH自由基和羥自由基清除能力均比發酵前有明顯提高。