酵母抽提物滋味成分分析及其復合調味料對鰱魚風味的影響

任佳懌，翟營營,*，黃晶晶，張慧敏，熊善柏，黃琪琳,*，朱建忠，李 沛，李 庫，沈 碩

（1.華中農業大學食品科技學院，國家大宗淡水魚加工技術研發分中心（武漢），湖北 武漢 430070；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）又稱白鰱、白魚，屬硬骨魚綱、鯉形目、鰱科、鰱亞科，是一種典型的濾食性魚類，生長速度快，抗病性強，產量高，是我國主要養殖魚類之一[1]。2017年我國淡水養殖總產量2 905.29萬 t，其中鰱魚產量為385.28萬 t，位居第二[2]。鰱魚蛋白質含量豐富，富含多種必需氨基酸，生物學效價高，多不飽和脂肪酸如二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等含量豐富，具有很高的營養價值[3-4]。清蒸的熟制方法能最大程度保持魚肉的營養價值，成品口感咸鮮，魚肉軟嫩，鮮香味美。雖然新鮮鰱魚營養豐富，但消費者對其接受度不高，主要原因是鰱魚魚肉滋味寡淡且腥味較重，因此，如何增強魚肉的鮮味，有效掩蔽其腥味成為一個亟待解決的問題。

酵母抽提物（yeast extract，YE）是由酵母細胞內的水溶性成分（主要是糖和氨基化合物）經酶解、濃縮制成的糊狀（約80%固體）或粉末狀（約96%固體）的濃縮物[5]。它與其他從肉類、植物、魚類中提取的成分一樣，是一種天然調味料，具有復雜的調味特性，主要體現在改善產品的鮮味、咸味、酸味、苦味和豐富度等方面，而這些是化學調味料所不具備的，因此也被稱為“第三代味精”[6]。此外，YE中還可以選擇性添加焦糖、蔬菜濃縮物、香料、味精（monosodiumL-glutamate，MSG）和5’-核苷酸，進一步豐富其調味特性[7-8]。GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》中明確規定，YE具有食品屬性，屬于一種天然食品配料，在食品加工中沒有使用范圍和添加量限制。近年來，YE作為一種具有豐富調味特性的天然調味料在食品中得到了廣泛的應用[9]，但是目前還鮮見將其應用在鰱魚增鮮去腥方面的研究。因此本實驗對YE的滋味成分進行分析，通過減除實驗和添加實驗確定YE中滋味的主要貢獻成分，再以白鰱魚片為研究對象，通過單因素試驗和正交試驗確定YE增鮮去腥的最優配比。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱魚 華中農業大學農貿市場；高核苷酸型YE（FIG18LS） 安琪酵母股份有限公司；核苷酸標準品（色譜純） 上海源葉生物技術有限公司；甲醇（色譜純）國藥集團化學試劑有限公司；天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸（食品級） 鄭州安安康食品有限公司；5’-CMP、5’-GMP、5’-IMP、5’-AMP（食品級） 浙江一諾生物科技有限公司；食鹽（食品級）重慶索特鹽化股份有限公司；蔗糖（食品級） 華海順達糧油調料有限公司。

1.2 儀器與設備

Avanti J-26xp型高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特有限公司；L-8900型氨基酸自定分析儀 日立高新技術公司；e2692高效液相色譜儀 美國Waters公司；TS-5000Z電子舌 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 游離氨基酸組成分析

準確稱取1.0 g YE，加入20 mL混合液（0.1 mol/L鹽酸-10%三氯乙酸1∶2）后旋渦振蕩，40 kHz超聲15 min；12 000 r/min離心20 min，取上清液10 mL，4 ℃靜置1 h，再以12 000 r/min離心20 min，取上清液5 mL，過0.22 μm濾膜，用氨基酸自動分析儀測定。

1.3.2 核苷酸組成分析

采用Pei Fei等[10]的方法并作適當修改。準確稱取1.0 g YE溶于50 mL超純水中，沸水浴1 min，冷卻后過0.45 μm濾膜備用。

色譜條件：色譜柱：大連依利特Hypersil ODS2-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：50 mmol/L磷酸二氫鉀，超聲脫氣后使用；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長254 nm；檢測時間20 min。

1.3.3 減除實驗

參考文獻[11-14]的方法，并作適當修改。將FIG18LS中測得的17 種游離氨基酸和4 種核苷酸共21 種組分配制成全組分溶液進行減除實驗。如果減除某種組分后，樣品滋味發生了顯著變化，則認為該組分是YE的主要滋味活性成分。為將樣品全部溶解且降低對感官評價員味覺的損壞，樣品溶液需稀釋50 倍后進行感官評價。感官采用“三點檢驗法”進行評價，7 個感官評價員進行3 次重復評價，然后對獲得的21 組數據進行統計學分析。

1.3.4 添加實驗

參考文獻[11-14]的方法，并作適當修改。將減除實驗中確定的n種滋味活性成分混在一起，組成混合溶液，再將減除實驗中的非滋味活性成分逐一加入，通過感官評價判斷其滋味變化，確定對滋味影響較大的組分。感官評價方法同1.3.3節。

1.3.5 單因素試驗

將新鮮白鰱魚清洗干凈后“三去”（去頭、去鱗、去內臟），切割成規則片狀（5 cm×4 cm×1 cm）[15]。準確稱取白鰱魚片200 g，用不同配比的調味料涂抹均勻后腌漬30 min，蒸煮10 min。以食鹽、YE和蔗糖為影響因子，預實驗確定較適宜的添加量分別為1.5%食鹽、1% YE、1%蔗糖。在此基礎上分別按照食鹽質量分數0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，YE質量分數0%、0.5%、1%、1.5%、2%，蔗糖質量分數0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%分別進行單因素試驗。

1.3.6 正交試驗

通過單因素試驗確定各因素水平后，再進行3水平3因素L9（33）正交試驗。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗設計因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in orthogonal array design

1.3.7 清蒸鰱魚片感官評價

感官評價小組由10 名經過嚴格培訓的評價員組成，男女各5 名。所有樣品在室溫下統一評定。要求評價員在評價之前和評價過程中禁止使用有香味的化妝品，且至少在評價前60 min避免接觸香煙及其他強烈味道或氣味。手上不應留有洗滌劑的殘留香氣。感官評價表如表2所示，滿分60 分。根據各指標對滋味影響的程度賦予不同的權重：色澤0.1，氣味（嗅聞）0.15，氣味（咀嚼）0.15，滋味0.4，組織狀態0.1，口感0.1。最后將總分換算為100 分。

表2 感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of steamed silver carp fillets

1.3.8 電子舌分析

參考王慧等[16]方法并作適當修改。準確稱取蒸熟的魚片30 g于燒杯中，加入200 mL去離子水，均質后靜置20 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，過濾后取80 mL倒入電子舌專用進樣杯中，于室溫完成測定。將每個樣品的數據采集時間設置為120 s，以1 s為周期采集數據，選取第120秒出現的響應值作為電子舌原始數據信號。電子舌傳感器每次檢測后均用去離子水進行清洗，清洗周期10 s。

1.4 數據分析

1.4.1 滋味活度值（taste active value，TAV）的計算

TAV的計算公式如下：

式中：C為滋味物質的含量/（mg/g）；T為滋味物質的閾值/（mg/g）。

當TAV≥1時，表明該滋味物質對樣品滋味有顯著影響，且數值越大貢獻越大；當TAV＜1時，表明該滋味物質對整體滋味貢獻不顯著[17]。

1.4.2 味精當量（equivalent umami concentrations，EUC）的計算

EUC表示與兩類鮮味物質混合物協同作用產生同樣的鮮味強度相當于MSG的量[18-19]，按式（2）計算：

式中：ai為鮮味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）的含量/（mg/g）；bi為鮮味氨基酸相對于MSG的相對鮮度系數（谷氨酸：1；天冬氨酸：0.077）；aj為呈味核苷酸（5’-IMP、5’-GMP、5’-AMP）的含量/（mg/g）；bj為呈味核苷酸相對于IMP的相對鮮度系數（5’-IMP為1；5’-GMP為2.3；5’-AMP為0.18）；12.18為協同作用常數。

實驗數據以Origin Pro 2015進行處理，采用SAS 9.2進行ANOVA單因素方差分析及Duncan檢驗（P＜0.05），以表示。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸組成及TAV

表3 YE游離氨基酸組成及TTAAVVTable 3 Free amino acid composition and taste activity value of yeast extrraacctt

由表3可知，YE游離氨基酸總量為171.49 mg/g，谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸總量為134.4 mg/g，占氨基酸總量的78.37%，是YE最主要的氨基酸。根據YE中氨基酸的呈味特性將氨基酸分為3 類，即鮮味/酸味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸[21]。由表3可知，YE中鮮味/酸味氨基酸含量最高，占氨基酸總量的48.33%，甜味氨基酸含量次之，苦味的氨基酸則只占氨基酸總量的17%；谷氨酸、丙氨酸和精氨酸是3 類氨基酸中含量最高的呈味氨基酸。精氨酸雖是苦味氨基酸，但呈現的是一種令人愉悅的苦味[22]。

谷氨酸的TAV為233.33，遠高于其他氨基酸，表明其對YE滋味貢獻最大。谷氨酸本身呈酸味，但當其以鈉鹽形式存在時具有很強的鮮味；丙氨酸是除谷氨酸外，對YE滋味貢獻最大的氨基酸。蘇氨酸、甘氨酸、脯氨酸的TAV小于1，說明它們對YE滋味貢獻程度較小。

2.2 YE核苷酸組成及TAV

表4 YYEE 55’-核苷酸組成及TTAAVVTable 4 5’-Nucleotide composition and taste activity value of yeast extract

5’-核苷酸是食品中常見的風味增效劑，在核苷酸的多種異構體中，只有5’-核苷酸才能顯示出鮮味增效作用；另外，5’-核苷酸6位上的羥基是產生風味增效作用所必需的[23]。5’-肌苷酸（5’-IMP）和5’-鳥苷酸（5’-GMP）6位上均為羥基，因此增鮮效果最強[24]。由表4可知，YE中5’-IMP的含量最高，5’-GMP次之，兩者占核苷酸總量的70.38%。5’-CMP含量雖然較高，但是由于結構不含羥基，對風味幾乎沒有影響。5’-AMP含量最低且其6位上是氨基，增鮮效果遠不及5’-IMP和5’-GMP。通過計算TAV可知，5’-GMP和5’-IMP的TAV分別為433.12和353.92，遠高于谷氨酸的TAV，表明在YE中5’-核苷酸對滋味的貢獻程度大于氨基酸；5’-AMP的TAV僅為2.9，對YE滋味的貢獻程度較小。

2.3 減除實驗

表5 YE減除實驗結果（一）Table 5 Omission test results of yeast extract (1)

將YE中主要滋味成分分成4 組進行減除實驗，每次實驗減去一個組分，通過感官評價其滋味變化。結果如表5所示，當A、B組和D組成分缺失時，YE的滋味發生了顯著變化。當A組成分缺失時，混合溶液鮮味顯著降低，咸味降低，回味不持久；當B組成分缺失時，混合溶液鮮味和咸味都降低，但是差異程度略低于A組；當C組成分缺失時，混合溶液滋味基本沒有變化；當D組成分缺失時，混合溶液的鮮味、咸味均顯著降低，且降低程度略高于A組，同時混合溶液甜味變得明顯；其他滋味類型變化不明顯。因此，根據上述結果，在減除實驗（二）中僅將有顯著性差異的組（A、B、D組）中的組分進行單獨減除。

表6 YE減除實驗結果（二）Table 6 Omission test results of yeast extract (2)

將組分減除后滋味發生明顯變化的3 個組中的每一種組分單獨減除，減除實驗的結果如表6所示。A組中谷氨酸鈉、丙氨酸、天冬氨酸鈉、精氨酸，D組中5’-GMP、5’-IMP減除后混合溶液的滋味發生了顯著變化。當谷氨酸鈉、丙氨酸缺失時，混合溶液的咸味、酸味和鮮味顯著降低，谷氨酸鈉缺失時滋味的差異程度高于丙氨酸；天冬氨酸鈉和精氨酸缺失時，混合溶液的咸味和鮮味顯著降低，甜味卻顯著提高，尤其是精氨酸缺失時，甜味提升最為明顯；5’-GMP缺失時混合溶液的甜味上升但鮮味下降；5’-IMP缺失時咸味、甜味和鮮味均顯著降低。B組中的組分在全部缺失時對混合溶液的滋味有顯著影響，但當分別減除時，混合溶液的滋味沒有顯著變化，表明B組對混合溶液滋味的影響是各組分共同作用的結果。

2.4 添加實驗

表7 添加實驗結果Table 7 Addition test results of yeast extract

將減除實驗中確定的6 種滋味活性成分配制成混合溶液，將非滋味活性成分逐一加入，通過感官評價分析混合溶液的滋味變化。

由表7可知，只有當酪氨酸和5’-AMP加入后，混合溶液的滋味發生了顯著變化，其他組分的加入對混合溶液的滋味均沒有顯著影響。當加入酪氨酸后，混合溶液的咸味下降，酸味和鮮味上升，同時伴有較濃厚的氨味；當加入5’-AMP后，混合溶液的咸味和甜味下降，鮮味增加。

通過減除實驗和添加實驗共確定了8 種滋味活性成分，分別為谷氨酸鈉、丙氨酸、天冬氨酸鈉、精氨酸、5’-GMP、5’-IMP、酪氨酸和5’-AMP。當混合溶液中缺失或者添加這些組分時，會對YE的滋味產生顯著影響。

2.5 EUC分析

表8 YE鮮味成分含量及EEUUCCTable 8 Contents of umami components in yeast extract and its EUC

滋味物質間存在復雜的相互作用，TAV只能評價單一滋味成分對滋味的貢獻，而無法將物質間的協同作用考慮在內。Yamaguchi等[25]在研究中發現了鮮味氨基酸和鮮味核苷酸的相互作用，并提出用EUC表示。Mau[26]則將EUC劃分為3 個等級，即＞10 g/g、0.1～10 g/g、＜0.1 g/g。由表8可知，鮮味物質總量僅為0.23 g/g，與EUC值之間存在較大差距，表明鮮味物質間存在很強的相互作用。該YE的EUC值為184.48 g/g，即1 g該YE在這種協同作用下產生的鮮味強度相當于184.48 g MSG所產生的鮮味強度，遠大于Mau[26]劃分的第一個等級，表明該YE具有很強的協同增鮮效果。

2.6 單因素試驗結果

2.6.1 YE添加量對清蒸魚片風味的影響

圖1 YE添加量對清蒸魚片風味的影響Fig. 1 Effect of yeast extract addition on the flavor of steamed silver carp fillets

由圖1可知，當YE添加量為1%時感官評分最高，增鮮效果最好，當添加量超過1%時，感官評分下降。這是由于YE添加量過高時，魚片鮮味過重且滋味變得酸澀，此時魚片呈現較重的YE的特征氣味，掩蓋了魚片本身的滋味，使其評分降低。

2.6.2 食鹽添加量對清蒸魚片風味的影響

食鹽的加入有利于YE中的谷氨酸轉變為谷氨酸鈉，提高食物的鮮味；同時鮮味的增強也會使食鹽的咸味得到緩和[27-28]。由圖2可知，當食鹽添加量為1%時，感官評分得到最大值。當不添加食鹽或食鹽添加量較低時，魚片滋味寡淡，鮮味較低；當食鹽添加量超過1.5%時，感官評分迅速下降，此時魚片具有明顯的咸味，而且過重的咸味也掩蓋了對鮮味的感知。

圖2 食鹽添加量對清蒸魚片風味的影響Fig. 2 Effect of salt addition on the flavor of steamed silver carp fillets

2.6.3 蔗糖添加量對清蒸魚片風味的影響

在鮮味物質中添加適度的糖可以起到去除腥味降低油膩感的效果；但糖添加過多時會掩蓋鮮味，甚至產生不良風味[23]。由圖3可知，當蔗糖添加量為1%時，魚片感官評分最高。感官評價過程中明顯的發現，當蔗糖添加量超過1.5%時，魚片會呈現明顯的甜味，且隨添加量的增加，甜味愈加明顯，對鮮味的掩蓋作用愈強。

圖3 蔗糖添加量對清蒸魚片風味的影響Fig. 3 Effect of sugar addition on the flavor of steamed silver carp fillets

2.7 正交試驗結果

2.7.1 感官評價正交試驗結果

表9 正交試驗感官評價結果Table 9 Orthogonal array design with sensory evaluation results

由表9可知，添加YE后對于魚片色澤有顯著影響，且影響程度隨YE添加量的增加而增大。添加YE可以很好地掩蔽魚肉腥味，并能賦予魚片濃厚的肉香味。有研究表明，YE含有多種呈烤香及肉香的氣味活性化合物，如吡嗪類和噻吩類等，可以對魚腥味起到很好的掩蔽作用[29-30]。添加YE可使魚片滋味醇厚，回味持久，但對滋味的促進作用并不隨YE含量的增加而增加；滋味得分最高的第1組其YE添加量為1%，當添加量為1.5%時，滋味得分反而出現了下降的趨勢。綜合各指標的感官評價得分，第1組的評分最高。

2.7.2 正交試驗設計與總分結果

在單因素試驗的基礎上，采用3因素3水平正交試驗研究增鮮去腥調味料的最佳配比。試驗設計與總分結果如表10所示。

對不同試驗組進行感官評價，并將其綜合評價結果進行分析。通過極差分析可以得知，影響清蒸魚片風味的因素主次為A＞C＞B，即在試驗各因素范圍內，食鹽對清蒸魚片的影響最大，其次為蔗糖，最后為YE。方差分析可知（表11），食鹽添加量對感官評分影響極顯著（P＜0.01），YE和蔗糖的添加量對感官評分影響不顯著。綜合考慮，選擇增鮮去腥調味料配比的最優方案為A1B1C1，即食鹽添加量1.5%、YE添加量1%、蔗糖添加量0.5%。

表10 感官評價總分正交試驗設計與結果Table 10 Results of orthogonal test

表11 感官評價總分方差分析Table 11 Analysis of variance of sensory evaluation results

2.8 電子舌分析

2.8.1 電子舌信號的主成分分析

圖4 清蒸白鰱魚片電子舌響應信號主成分分析Fig. 4 PCA plot of electronic tongue data for steamed silver carp fillet

由圖4可知，2 個主成分貢獻之和為96.65%，表明這兩個主成分可以很好的代表樣品的總體滋味特征。圖中空白魚片主要沿第1主成分軸正向分布，而調理后的魚片則向第1主成分軸的負方向移動，在第2主成分軸上分布較為集中；2 個樣品組之間空間分布距離較遠，表明調理之后的魚片滋味發生了很大變化。實驗結果表明，電子舌可以有效的將空白魚片和調理后的魚片區分開。

2.8.2 電子舌分析魚片滋味的變化

如圖5所示，電子舌分析結果表明，空白魚片苦味明顯，酸味較輕。經過增鮮去腥調味料腌漬以后，鮮味得到了明顯的提高，咸味增加較為顯著，酸味略有增加，苦味顯著降低，豐富性、收斂性和回味變化不明顯。

圖5 清蒸鰱魚片滋味雷達圖Fig. 5 Taste radar chart of steamed silver carp fillets

3 結 論

YE滋味物質含量豐富，其中谷氨酸鈉、丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、5’-IMP、5’-GMP、酪氨酸、5’-AMP是其滋味的主要貢獻成分，且鮮味氨基酸（谷氨酸鈉和天冬氨酸鈉）與鮮味核苷酸（5’-GMP、5’-IMP和5’-AMP）存在顯著的協同增鮮效果，使得該YE的鮮度極高（EUC高達184.48 g/g）。因此以該YE為配料之一，加以食鹽和蔗糖開發魚制品的增鮮去腥復合調味料。結果發現YE、蔗糖、食鹽添加量為1%、0.5%、1.5%時，組成的復合調味料能使清蒸魚片的鮮味增強，苦味和腥味減弱，具有很高的實用價值。