酶解大豆分離蛋白-磷脂復合乳液的制備及穩定性分析

鄭建樟，管軍軍*，路新開，劉 雪，朱 浩，冀旭陽

（河南工業大學生物工程學院，河南 鄭州 450000）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種可以代替動物蛋白的植物高蛋白產品，蛋白含量大于90%，可以直接作為人體蛋白質的主要來源[1]，SPI的高蛋白含量和獨特的結構表現出了一系列的功能特性，主要包括乳化性、溶解性、起泡性、黏性、結團性、組織性、水合性、吸油性、膠凝性、起泡性、結膜性和調色性等[2]；其中，乳化性是較為重要的一種性質，是維持乳液穩定的主要特性，利用蛋白質分子結構中的親水、親油基吸附在油-水界面上，形成一層膜，從而阻止油滴的聚集，起到穩定乳化的效果，使乳液更加穩定[3]。SPI在胃環境中易被胃蛋白酶水解，直接用SPI制備乳液，在胃中不穩定。酶解SPI因為已經被胃蛋白酶降解完全，所以在胃中胃蛋白酶不會再降解酶解過的SPI，使蛋白在胃中相對穩定。

磷脂是一種天然的表面活性劑，具有優良的乳化性、擴散性和浸潤性，添加或噴涂到乳粉或豆粉上可提高產品的分散性和水溶性，是一種天然食品添加劑，現已廣泛用于烘焙食品、人造奶油、醫藥保健等行業中[4-8]。

在真實的食品體系中，不只含有一種表面活性物質，例如在豆奶中，蛋白質和磷脂都具有表面活性；牛奶中也含有多種不同的表面活性物質，包括各種蛋白和磷脂。傳統豆制品在加工中易形成乳化體系，其中存在的SPI與磷脂的交聯作用對乳化體系有一定影響。磷脂的復合對SPI的功能性，尤其是乳化活性產生重要影響，且磷脂與不同變性程度的蛋白結合的穩定性也不同，這表明磷脂的結合對SPI功能性的改善有重要作用[9-15]。本實驗通過對SPI改性，使酶解SPI-磷脂復合乳液在胃環境中（pH 2.0）穩定，以期為工業生產中提供一種運油性物質的天然活性載體提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆 市購；大豆卵磷脂粉末 鄭州四維生物科技有限公司；金龍魚大豆油 益海嘉里食品營銷有限公司；胃蛋白酶（1 000 NFU/mg） 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

FA 25高剪切分散乳化機 德國Fluko公司；FD-1冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；Zetasizer Nano納米粒度、Zeta電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；BH200生物顯微鏡 舜宇光學科技集團有限公司；722N可見分光光度計 上海精科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI及酶解SPI的制備

SPI制備：采用文獻[16-17]的方法。將大豆粉碎后過80 目篩，用石油醚脫脂，所得脫脂豆粉加10 倍蒸餾水磁力攪拌1 h，攪拌時用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至8.0加速溶解，然后50 ℃水浴加熱1 h，5 000 r/min離心30 min。離心所得上清液用2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.8后4 ℃過夜，次日5 000 r/min離心50 min，取沉淀復溶，調pH值至7.0，冷凍干燥即得SPI。

SPI水解：3% SPI分散于水中，調節pH值至2.0，溫度37 ℃，攪拌10 min，加入胃蛋白酶（酶與底物比1∶100），進行酶反應，反應過程中保持pH值恒定。當反應時間分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、90、120、150、180、210、240 min時取1 mL反應液，高溫滅酶。參考文獻[18-20]的方法：取各個時間的蛋白水解液用蒸餾水稀釋100 倍，取2.00 mL稀釋液于試管中并加入1.00 mL顯色劑，混勻后置沸水浴中加熱15 min，同時做空白實驗，然后冷水冷卻，加入5.00 mL 40%乙醇溶液混勻，放置15 min后用1 cm比色杯，以空白管調零于波長570 nm處測定吸光度。然后以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標作圖，找到酶解完成時間120 min。

酶解SPI的制備：配制3% SPI溶液，調節pH值至2.0，溫度37 ℃，攪拌時間10 min，加入胃蛋白酶（酶與底物比1∶100），進行酶反應，反應過程中保持pH值恒定。反應120 min后停止反應，調節pH值至7.0滅酶，冷凍干燥即得酶解SPI。

1.3.2 酶解SPI-磷脂復合乳液的制備

按照一定比例配制酶解SPI-磷脂復合乳液：取適量的酶解SPI用水溶解后20 000 r/min均質2 min，取一定量均質后的酶解SPI溶液和磷脂溶液混合，再加入適量的大豆油，20 000 r/min均質2 min，調pH值至2.0或7.0。

1.3.3 單因素試驗

酶解SPI質量濃度：固定磷脂添加量0.001 0 g/mL、油相體積分數20%，酶解SPI質量濃度分別為0.001 0、0.002 5、0.010 0、0.015 0 g/mL和0.020 0 g/mL。

磷脂添加量：固定酶解SPI質量濃度0.010 0 g/mL、油相體積分數20%，磷脂添加量分別為0.000 5、0.001 0、0.002 0、0.005 0、0.010 0 g/mL和0.020 0 g/mL。

油相體積分數：固定酶解SPI質量濃度0.010 0 g/mL、磷脂添加量0.001 0 g/mL，油相體積分數分別為5%、10%、20%、25%、35%、45%。

1.3.4 正交試驗設計

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 顯微鏡觀察

樣品均質后，取50 μL乳液置于載玻片上，在物鏡40 倍下觀察乳液液滴形態。

1.3.6 乳液的粒徑及Zeta電位測定

采用Zetasizer Nano測定乳狀液滴的粒徑大小及Zeta電位[21-23]。取50 μL乳液稀釋到5.00 mL，然后取1 mL稀釋液測定粒徑及Zeta電位。

1.3.7 乳液的乳化活性指數（emulsification activity index，EAI）和乳化穩定指數（emulsion stability index，ESI）測定

參考文獻[23-27]的方法。取50 μL乳液以0.001 0 g/mL十二烷基硫酸鈉（pH 7.0）稀釋500 倍，以十二烷基硫酸鈉溶液為空白，測定波長500 nm處吸光度。測定0、30 min后溶液的吸光度A0、A30。按式（1）、（2）計算EAI及ESI：

式中：N為稀釋倍數（500）；C為蛋白質量濃度/（g/mL）；Φ為油相體積分數/%；ΔA＝A30－A0；ΔT為30 min。

1.3.8 乳層析指數測定

參考文獻[27-30]的方法測定乳液層析指數，取10 mL的乳液于具塞比色管中，室溫下觀察乳液分層情況并拍照。按式（3）計算乳層析指數：

式中：H清、H分別為下清液體積、乳液總體積/mL。

1.4 數據處理

每個實驗指標測定3 次，取用SAS 9.0統計學軟件進行數據分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 酶解時間的確定

圖1 SPI酶解時間對吸光度的影響Fig. 1 Effect of hydrolysis time of SPI on absorbance

從圖1可以看出，隨著酶解時間的延長，吸光度先變大再趨于穩定，在水解120 min后，吸光度穩定。這是由于在120 min時，SPI已經被胃蛋白酶基本完全降解。

2.2 酶解SPI質量濃度對復合乳液的影響

2.2.1 不同酶解SPI質量濃度復合乳液顯微鏡觀察

圖2 不同酶解SPI質量濃度復合乳液顯微圖Fig. 2 Micrographs of composite emulsions with different concentrations of SPI hydrolysate

如圖2所示，在酸性（pH 2.0）條件下，隨著酶解SPI質量濃度的增加，乳液液滴逐漸變小；在堿性（pH 7.0）條件下，隨著酶解SPI質量濃度的增加，乳液液滴逐漸變小，其中0.010 0、0.015 0 g/mL和0.020 0 g/mL中乳液液滴較小，分布均勻，排列緊密。隨著酶解SPI質量濃度的增加，可以觀察到乳液的液滴越來越小，排列分布越來越均勻、緊密；這是由于蛋白分子中的親油基團和親水基團與油、水結合。說明酶解SPI在一定質量濃度范圍內，會與磷脂結合，降低界面張力，阻止油滴的聚集，形成較小的液滴，起到維持乳液穩定的作用。在相同條件下，乳液在pH 2.0時的液滴相對pH 7.0時大，液滴均一差。這是由于酶解SPI在pH 7.0時在水中的溶解性比pH 2.0時穩定。

2.2.2 不同酶解SPI質量濃度復合乳液的粒徑和電位

圖3 不同酶解SPI質量濃度復合乳液的粒徑、Zeettaa電位Fig. 3 Particle size and potential of composite emulsions with different concentrations of SPI hydrolysate

一般情況下，當乳液中的體積平均粒徑越小，乳液的乳化性越好，越穩定。如圖3所示，當pH 2.0時，乳液的Zeta電位均為正值，當酶解SPI質量濃度增加時電位先增大后穩定，當酶解SPI質量濃度在0.010 0 g/mL時，Zeta電位達到穩定，為15.7 mV；當酶解SPI質量濃度增加時粒徑總體呈先減小再增大再減小再增大趨勢，當酶解SPI質量濃度在0.001 0 g/mL時，由于蛋白含量太低，蛋白與磷脂結合不足，自由的磷脂較多，所以乳液整體粒徑較小，當酶解SPI質量濃度為0.010 0 g/mL時，粒徑為1 372 nm。所以在pH 2.0時，酶解SPI質量濃度在0.010 0 g/mL時，復合乳液最穩定，這是由于酶解SPI具有兩性，適當的酶解SPI可以提高乳液的穩定性，過量的蛋白會導致在復合乳液中蛋白分布不均勻，乳液穩定性降低。

2.2.3 不同酶解SPI質量濃度復合乳液的ESI和EAI

圖4 不同酶解SPI質量濃度復合乳液ESII、EEAAIIFig. 4 ESI and EAI of composite emulsions with different concentrations of SPI hydrolysate

如圖4所示，當pH 7.0時，隨著酶解SPI質量濃度的增加，EAI呈減小趨勢，ESI總體先增大后趨于穩定。在同一酶解SPI質量濃度條件下，pH 2.0時的乳液EAI比pH 7.0大。

當pH 2.0時，隨著酶解SPI質量濃度的增加，EAI呈減小趨勢，ESI總體呈先增大后穩定趨勢，當酶解SPI質量濃度為0.020 0 g/mL時，復合乳液ESI最大。

2.2.4 不同酶解SPI質量濃度復合乳液乳化層析

圖5 不同酶解SPI質量濃度復合乳液乳化層析Fig. 5 CI of composite emulsions with different concentrations of SPI hydrolysate

乳層析指數越小，復合乳液越穩定。如圖5所示，當酶解SPI質量濃度增加時乳層析指數呈減小趨勢；當酶解SPI質量濃度為0.020 0 g/mL時，復合乳液最穩定（pH 2.0）。

2.3 磷脂添加量對乳液的影響和最適酶解SPI磷脂比例的確定

2.3.1 不同磷脂添加量復合乳液的顯微鏡觀察

圖6 不同磷脂添加量復合乳液的顯微圖Fig. 6 Micrographs of composite emulsions with different concentrations of phospholipids

如圖6所示，當pH 2.0時，隨著磷脂添加量的增加，乳液液滴逐漸變大，當磷脂添加量不小于0.005 0 g/mL，乳液的液滴明顯增大；當pH 7.0時，隨著磷脂添加量的變化，乳液液滴基本沒有變化。這說明磷脂分子在中堿性條件下比酸性條件下更容易和蛋白分子結合，形成的乳液更加穩定，乳液的液滴較小。在相同條件下，乳液在pH 2.0時的液滴比pH 7.0時大，液滴均一性差。這是由于磷脂在pH 7.0時比pH 2.0時更容易和蛋白結合。

2.3.2 不同磷脂添加量復合乳液的粒徑和電位

圖7 不同磷脂添加量復合乳液的粒徑、Zeettaa電位Fig. 7 Particle size and potential of composite emulsions with different concentrations of phospholipids

如圖7所示，當pH 2.0時，乳液的Zeta電位隨著磷脂添加量增加先不變再變小，由正值變為負值。當磷脂添加量小于0.002 0 g/mL，Zeta電位穩定，大于0.002 0 g/mL時，Zeta電位隨磷脂添加量增大而變小，磷脂添加量為0.002 0 g/mL時，Zeta電位為14.57 mV；當磷脂添加量大于0.005 0 g/mL時，粒徑相對穩定，在1 853.00 nm左右。所以在pH 2.0時，磷脂添加量在0.002 0 g/mL時，復合乳液最穩定。當pH 7.0時，乳液的Zeta電位均為負值，當磷脂添加量增加時Zeta電位先增大再減小后趨于穩定，當磷脂添加量為0.005 0 g/mL時，Zeta電位達到最大值，為－43.067 mV；當磷脂添加量增加時粒徑總體呈先減小再增大趨勢，當磷脂添加量為0.005 0 g/mL時，粒徑達到最小值，為673.60 nm。所以在pH 7.0時，磷脂添加量在0.005 0 g/mL時，復合乳液最穩定。

2.3.3 不同磷脂添加量復合乳液的ESI和EAI

圖8 不同磷脂添加量復合乳液的EAII和EESSIIFig. 8 EAI and ESI of composite emulsions with different concentrations of phospholipids added

如圖8所示，當pH 2.0時，隨著磷脂添加量的增加，EAI先增大再減小，ESI總體呈先增大再減小趨勢，當磷脂添加量為0.001 0 g/mL時，復合乳液的EAI最高，乳液的ESI最大。當pH 7.0時，隨著磷脂添加量的增加，EAI呈增大趨勢，ESI總體先增大再穩定，當磷脂添加量在0.001 0 g/mL時，復合乳液的ESI最大。在同一磷脂添加量下，pH 2.0時的乳液EAI和ESI比pH 7.0時小。

2.3.4 不同磷脂添加量復合乳液的乳化層析

圖9 不同磷脂添加量復合乳液的乳化層析Fig. 9 CI of composite emulsions with different concentrations of phospholipids

如圖9所示，當磷脂添加量增加時乳層析指數呈增大趨勢；當磷脂添加量為0.001 0 g/mL時，復合乳液最穩定。

2.4 油相體積分數對乳液的影響和最適油相比例的確定

2.4.1 不同油相體積分數復合乳液的顯微鏡觀察

如圖10所示，當pH 2.0時，隨著油相體積分數的增加，乳液液滴逐漸變大，當油相體積分數不小于35%時，乳液的液滴明顯增大；pH 7.0條件下，隨著油相體積分數的變化，乳液液滴基本沒有變化，當油相體積分數在45%時，乳液的液滴明顯變大。這說明在低油條件下，形成的乳液更加穩定，乳液的液滴較小。在相同條件下，乳液在pH 2.0時的液滴比pH 7.0大，液滴均一性差。這是由于蛋白在pH 7.0時親油基團比pH 2.0時更容易大豆油結合，從而阻止油滴的聚集，達到穩定乳化的作用。

圖10 不同油相體積分數復合乳液的顯微圖Fig. 10 Micrographs of composite emulsions with different oil phase volume fractions

2.4.2 不同油相體積分數復合乳液的粒徑和電位

圖11 不同油相體積分數復合乳液的粒徑、Zeettaa電位Fig. 11 Particle size and potential of composite emulsions with different oil phase volume fractions

如圖11所示，當pH 2.0時，乳液的Zeta電位均為正值，油相體積分數增大時乳液的Zet a電位先增大后穩定，當油相體積分數為20%時，Zeta電位達到最大值，為10.77 mV；當油相體積分數增加時粒徑總體先增大再趨于穩定，當油相體積分數為20%時，粒徑達到穩定。當pH 7.0時，乳液的Zeta電位均為負值，當油相體積分數增加時，Zeta電位先減小后穩定，當油相體積分數為25%時，Zeta電位達到穩定，為－51.57 mV；當油相體積分數增加時，粒徑總體呈先增大再減小再增大趨勢，當油相體積分數在20%時，粒徑達到最大值，為2 377.33 nm。當pH 2.0時，乳液的粒徑和Zeta電位比pH 7.0大，這是由于蛋白在pH 7.0時親油基團比pH 2.0時更容易與大豆油結合，從而阻止油滴的聚集，達到穩定乳化的作用。

2.4.3 不同油相體積分數復合乳液的ESI和EAI

圖12 不同油相體積分數復合乳液的EAII和EESSIIFig. 12 EAI and ESI of composite emulsions with different oil phase volume fractions

如圖12所示，pH 2.0和pH 7.0條件下，隨著油相體積分數的增加，EAI呈減小趨勢，ESI總體呈減小趨勢。

2.4.4 不同油相體積分數復合乳液的乳化層析

圖13 不同油相復合乳液的乳層析Fig. 13 CI of composite emulsions with different oil phase volume fractions

如圖13所示，當油相體積分數增加時，乳層析指數呈減小趨勢。

2.5 正交試驗結果

從表2可以看出，直觀分析得到理論上pH 2.0時Zeta電位的最優組合為A3B1C1，粒徑的最優組合為A3B1C1，EAI的最優組合為A3B1C1，ESI的最優組合為A3B1C1，乳層析指數的是最優組合為A3B1C3。

通過綜合評分法，對各指標按照優劣轉換為單指標評分，其中最優值為10.00，最劣值為1.00，其余按比例給分，因為各指標重要性大致相同，取5 個指標評分之和為綜合評分。由表2、3可知，各因素主次順序為C、B、A，得出最優組合A3B1C1：酶解SPI質量濃度為0.020 0 g/mL，磷脂添加量為0.000 5 g/mL，油相體積分數為10%。

表2 pH 2.0時正交試驗設計與結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results for composite emulsions at pH 2.0

表3 pH 2.0時綜合評分Table 3 Comprehensive evaluation scores of composite emulsions at pH 2.0

按最優組合A3B1C1進行實驗得出的指標：Zeta電位為17.09 mV，粒徑為1 278.00 nm，EAI為1.803 m2/g，ESI為708.25 min，乳層析指數為0.79，綜合評分為49.40；與其他9號試驗相比最優組合。

從表4可以看出，直觀分析得到理論上pH 7.0時Zeta電位的最優組合為A2B3C2，粒徑的最優組合為A1B3C2，EAI的最優組合為A3B2C1，ESI的最優組合為A3B2C1，乳層析指數的最優組合為A2B1C3。

通過綜合評分法，由表4、5可知，各因素主次順序為C、B、A，得出最優的組合為8號試驗A3B2C1：酶解SPI質量濃度0.020 0 g/mL，磷脂添加量0.001 0 g/mL，油相體積分數10%。經驗證，最優條件為酶解SPI質量濃度0.020 g/mL，磷脂添加量0.001 0 g/mL，油相體積分數10%。

表4 pH 7.0時正交試驗設計結果Table 4 Orthogonal array design with experimental results for composite emulsions at pH 7.0

表5 pH 7.0時綜合評分Table 5 Comprehensive evaluation score of composite emulsions at pH 7.0

3 結 論

酶解120 min后SPI酶解完全。通過單因素試驗得出：適當增加SPI質量濃度，可以提高酶解SPI-磷脂復合乳液的穩定性；低磷脂添加量時，酶解SPI-磷脂復合乳液的穩定性較好；酶解SPI-磷脂復合乳液的穩定性隨著油相體積分數的增加而降低。通過正交試驗設計，當pH 7.0時，酶解SPI-磷脂復合乳液最佳穩定性條件為酶解SPI質量濃度0.020 0 g/mL、磷脂添加量0.001 0 g/mL、油相體積分數10%。當pH 2.0時，酶解SPI-磷脂復合乳液最佳穩定性條件為酶解SPI質量濃度0.020 0 g/mL、磷脂添加量0.000 5 g/mL、油相體積分數10%。為了得到過胃保護的載體，胃環境（pH 2.0）酶解SPI-磷脂復合乳液最佳穩定性條件為酶解SPI質量濃度0.020 0 g/mL、磷脂添加量0.000 5 g/mL、油相體積分數10%。