食品中Escherichia coli O157:H7微滴數字PCR絕對定量檢測方法的建立

魏詠新，馬 丹，李 丹，徐蕾蕊，魏海燕，張西萌，劉 莉，曾 靜*

（北京海關技 術中心，北京 100026）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）O157:H7是一種重要的人獸共患傳染病原菌[1-2]，是腸道出血性E. coli中對人致病性最強的血清型之一，以食物為主要的傳播途徑，牛、羊、豬 和雞等家畜家禽為主要宿主[3]，其產生的細菌毒素，可引起出血性結腸炎，可發展成溶血性尿毒綜合癥和血小板減少性紫癜，嚴重者可致死亡[4]。世界上多個國家都曾有過不同規模的E. coli致病事件爆發和流行，1982年美國首次報道了由E. coliO157:H7引發的出血性腸炎，緊隨其后加拿大、日本、英國等國也接連報道了E. coliO157:H7的爆發[5-7]。我國江蘇、安徽省也曾經在1999年爆發E. coliO157:H7感染性腹瀉，超過2萬 例患者，死亡177 例，流行時間達7 個月之久[8]。

因為致病菌長期與人類共存，國內關于食品中致病菌存在和計數要采用危險性評估的方法代替零容許值的問題正引起日益激烈的爭論，在這種情況下致病菌定量檢測方法尤為重要[9]。致病菌定量快速檢測對于執行食品微生物限量標準、對食品中的致病微生物進行風險評估更具有實際的意義[10]。GB 4789.36—2016《食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》[11]采用傳統分離培養法（或免疫磁珠捕獲法）、生化確認與血清學實驗結合的檢測方法，檢測周期長，操作復雜且只能實現定性檢測。目前我國還沒有制定E. coliO157:H7定量檢測標準，因此本研究旨在建立食品中E. coliO157:H7的絕對定量檢測方法，對E. coliO157:H7的污染水平提供數據依據，為食品安全檢測、開展風險評估等工作提供有效的思路和借鑒。

現有常用的致病菌定量檢測方法包括平板法、最大可能數（maximum probable number，MPN）法[12]和分子生物學檢測方法等。平板法是常用的活菌計數方法，操作繁瑣、檢測周期長、誤差大[13]，不同分離平板對致病菌計數有一定的影響[14]。MPN法屬于半定量檢測方法[15-16]，為提高檢測速度及敏感性，多與聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法結合應用[17-18]。平板法和MPN方法在涉及大量樣本的情況下需要大量人力[19]。分子生物學檢測方法因具有靈敏度高、特異性強、操作簡便等優點，在微生物的檢測中發揮了巨大的作用[20]。近年來，以real-time PCR為代表的分子生物學技術也逐漸被廣泛應用到致病菌的定量檢測中。相比較于傳統培養法，real-time PCR法快速、簡便、靈敏、特異[21]，但該方法屬于相對定量，結果的準確性和重復性在很大程度上依賴于標準曲線質量及擴增效率，并且需要具備已知濃度的核酸標準品。新興的微滴數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）被認為是第3代核酸擴增技術[22]，通過把稀釋到一定濃度的DNA分子分布于10 000～20 000 個微滴中，使大部分微滴中DNA分子的數量為1或0，然后通過PCR擴增和陽性信號的累積讀取陽性反應單元數，再根據泊松分布計算出樣本中的DNA分子數，從而實現對DNA分子的絕對定量[23-24]。針對現有檢測方法的不足，本研究擬采用ddPCR技術建立食品中E. coliO157:H7的快速準確絕對定量方法，為制訂食品微生物定量檢測標準提供思路和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表1 實驗菌株Table 1 List of experimental strains

86 株菌（表1），其中包括4 株E. coliO157:H7標準菌株（CICC 24187、CICC 21530、CICC 10669、FEPAS O157），實驗室保存的1 株E. coliO157:H7，1 株產腸毒素（Enterotoxigenic）E. coli標準菌株，1 株腸道致病性（Enteropathogenic）E. coli標準菌株，1 株腸道侵襲性（Enteroinvasive）E. coli標準菌株，1 株腸道集聚性（Enteroaggregative）E. coli標準菌株，2 株其他E. coli標準菌株，55 株實驗室分離E. coli，以及18 株其他常見的食源性致病菌標準菌株。所有菌株分別在BHI瓊脂平板或2% TSA瓊脂平板（活化弧菌）上活化3 代后，挑取單菌落分別接種于10 mL BHI液體培養基或10 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水（弧菌培養）中，37 ℃、160 r/min振蕩培養18 h，取1 mL菌液進行10 倍梯度稀釋至10－8，用于細菌基因組DNA的提取。

1.2 儀器與設備

培養基 北京陸橋技術股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（貨號：DP302） 天根生化科技有限公司；THZ-C-1臺式全溫振蕩器 蘇州培英實驗設備有限公司；Stomacher 400高效拍打式勻漿器 英國Seward公司；5424小型高速離心機 德國Eppendorf公司；Fr-1io cell恒溫培養箱 德國MMM公司；Nanodrop2000超微量分光光度計 美國Thermo公司；QX200 ddPCR系統 美國伯樂公司；7900HT Fast real-time PCR儀、GeneAmp 9700 PCR儀 美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 引物探針設計、合成與篩選

參考國內外研究[1,25-26]，選取E. coliO157:H7具有種屬特異性且高度保守的單拷貝溶血素前體蛋白基因hlyA（GenBank EU118026.1）作為靶序列，通過NCBI在線工具進行序列分析和比對，利用Prime Express軟件V3.0（ABI, Foster City, CA, USA）設計出引物/探針1 套，序列見表2。探針5’端標記FAM，3’端標記BHQ。

表2 ddPCR引物探針序列Table 2 Primer and probe sequences used for ddPCR

首先，利用該引物/探針通過real-time PCR對表1中所有菌株進行檢測，進而通過ddPCR對表1中E. coliO157:H7菌株和其他致瀉大腸標準菌株及其他近源菌進行檢測，驗證該引物探針的有效性和特異性。

1.3.2E. coliO157:H7純培養液的DNA濃度、平板計數及PCR檢測

1.3.2.1 基因組DNA提取與超微量分光光度計測定

E. coliO157:H7 CICC 21530的10 mL BHI過夜培養物（160 r/min、37 ℃搖床振蕩培養18 h），取1 mL以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）進行10 倍梯度稀釋。取過夜培養物原液至10－8稀釋度菌液各1 mL采用試劑盒法提取DNA，按照試劑盒說明將核酸溶解在50 μL TE緩沖液中。對提取的純培養液核酸用超微量分光光度計進行濃度和純度的測定，確保提取核酸的A260nm/A280nm在1.8～2.0之間，并按下式[19]計算提取E. coliO157:H7基因組DNA濃度：

式中：m為超微量分光光度計測得的核酸質量濃度/（ng/μL）；n為細菌基因組的長度/bp；根據NCBI上已經發布的E. coliO157:H7基因組的測序數據，其平均長度為5.144×106bp。

1.3.2.2 平板計數

取1.3.2.1節中10 倍梯度稀釋的E. coliO157:H7 CICC 21530純培養液10－6、10－7、10－8稀釋度進行平板計數，吸取1 mL各稀釋度的菌懸液分別加于2 個無菌平皿內。及時將15～20 mL冷卻至46 ℃的平板計數瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，36 ℃倒置培養（24±2）h。選取菌落數在30～300 CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數，每個稀釋度菌落數取兩個平板計數結果的平均值。

1.3.2.3 real-time PCR檢測

取1.3.2.1節中過夜培養物原液至10－8稀釋度菌液各1 mL提取的DNA進行real-time PCR檢測，作標準曲線。real-time PCR體系中上下游引物hlyA-F、hlyA-R和探針hlyA-P濃度均為500 nmol/L，然后加入10 μL 2×PCR master mix，DNA模板2 μL，用去離子水補足20 μL。反應體系置于real-time PCR儀中進行擴增。擴增條件為50 ℃酶激活2 min；95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火及延伸1 min，40 個循環。反應完成后利用SDS 3.2軟件進行分析。

經超微量分光光度計測得純培養液核酸濃度，代入1.3.2.1節公式算得提取到的目標菌基因組DNA濃度（拷貝數/μL），根據體積算得試劑盒法提取的50 μL中目標菌基因組濃度（拷貝數/50 μL），也就是1 mL菌液中的濃度（拷貝數/mL），設計引物探針的hlyA基因為單拷貝基因，1拷貝基因組對應1 個CFU菌落，可得到1 mL菌液中的細菌個數（CFU/mL）。

1.3.2.4 ddPCR檢測

表3 ddPPCCRR體系Table 3 Composition of ddPCR reaction system

取1.3.2.1節過夜培養物原液至10－8稀釋度菌液提取的DNA同時進行ddPCR檢測。將20 μL的ddPCR預混液（表3）和70 μL微滴生成油分別加入到8 孔微滴生成卡中，置于微滴生成儀中生成微滴。將生成的油包水的微滴（40 μL）緩慢轉移至96 孔板中，封膜后置于PCR儀上進行擴增反應（升降溫速率≤2.5 ℃/s）：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火及延伸1 min，45 個循環；98 ℃固化微滴10 min；4 ℃反應結束。將擴增后的96 孔板置于微滴讀取儀中，利用QuantaSoft軟件進行結果讀取和分析。

ddPCR可直接測得每反應的目標基因濃度（拷貝數/反應），即試劑盒法提取的DNA中2 μL的目標基因濃度，計算可得50 μL中的目標基因濃度（拷貝數/50 μL），即1 mL菌液中的目標基因濃度（拷貝數/mL），1拷貝基因對應1 個CFU菌落，也就是1 mL菌液中的細菌個數（CFU/mL）。

1.3.3 人工污染三文魚樣品的平板計數、real-time PCR、ddPCR定量檢測

選擇GB 4789.36—2016[11]驗證無E. coli O157:H7的三文魚樣品作為食品添加基質。取E. coli O157:H7 CICC 21530過夜培養菌懸液的10－3、10－4、10－5、10－6、10－7稀釋度菌液各25 mL分別添加到盛有無菌稱樣25 g三文魚肉樣品的均質袋中，各添加水平分別設3 個樣品重復，另無菌稱取1 份25 g三文魚肉樣品加入25 mL PBS代替添加菌液作為陰性對照，用拍擊式勻漿器拍擊2 min，制成系列1∶1含有不同添加水平E. coli O157:H7的污染樣品。對以上5 個添加水平的每份人工污染三文魚樣品分別梯度稀釋進行平板計數。

取以上5 個添加水平的每份人工污染三文魚樣品勻漿液各2 mL（含1 g三文魚樣品）用試劑盒法提取DNA，最終將核酸溶解在50 μL TE緩沖液中，分別進行real-time PCR和ddPCR檢測。real-time PCR以1.3.2.1節梯度稀釋的純培養液DNA作為標準品，以檢測Ct值為縱坐標，核酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，將人工污染三文魚樣品勻漿液中提取DNA檢測Ct值代入回歸公式，得到其核酸濃度，代入1.3.2.1節公式得到目標菌基因組DNA的拷貝數（拷貝數/μL），按照1.3.2.3節計算可得2 mL勻漿液中的細菌個數，即1 g三文魚肉樣品中的細菌個數（CFU/g）。

ddPCR直接測得每反應的目標基因拷貝數（拷貝數/反應），按照1.3.2.4節計算可得2 mL勻漿液中的細菌個數，也就是1 g三文魚肉樣品中的細菌個數（CFU/g），從而得到平板計數、real-time PCR及ddPCR 3 種測定方法統一的測定值計算單位，比較平板計數、real-time PCR及ddPCR的測定值效果。

2 結果與分析

2.1 方法特異性分析

real-time PCR方法驗證引物和探針的特異性。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取表1中所列菌株純培養物的基因組DNA，結果表明，7 株E. coli O157:H7菌株（CICC 24187、CICC 10669、實驗室自存E. coli O157:H7菌3 株、FEPAS O157、CICC 21530）均出現陽性擴增信號，而其他E. coli及常見的食源性致病菌檢測均呈陰性（圖1A）。

為了進一步驗證ddPCR方法的特異性，梯度稀釋7 株E. coli O157:H7菌株（CICC 24187、CICC 10669、實驗室自存E. coli O157:H7菌3 株、FEPAS O157、CICC 21530）及8 株近源菌株（Enterotoxigenic E. coli CICC 24190、Enteropathogenic E. coli CICC 24189、Enteroinvasive E. coli CICC 24188、Enteroaggregative E. coli CICC 24186、E. coli CICC 10003、E. coli ATCC 25922、實驗室自存E. coli 2 株、S. flexneri ATCC 12022）的各基因組DNA稀釋至10－4，用于ddPCR檢測，每個樣品設2 個平行重復，同時以無菌水代替模板作為陰性對照。結果發現7 株E. coli O157:H7菌株均出現陽性擴增信號，而其他E. coli及常見的食源性致病菌檢測均呈陰性，無陽性微滴（圖1B），證明該組引物探針在ddPCR擴增體系中具有良好的特異性。

圖1 hhllyyAA引物探針real-time PCR（A）和ddPCR（B）特異性結果Fig. 1 Comparison of speci ficity for hlyA between real-time PCR (A)and ddPCR (B)

2.2 E. coli O157:H7 CICC 21530純培養液的3 種檢測方法測定值

2.2.1 real-time PCR測定值

取E. coli O157:H7 CICC 21530過夜培養物1 mL，提取基因組DNA經超微量分光光度計測定質量濃度為671 ng/μL，代入1.3.2.1節公式算得提取到的基因組DNA濃度為1.19×108拷貝數/μL，按照1拷貝基因組對應1 個CFU菌落，則原始菌液菌落數為9.77（lg（CFU/mL））。

2.2.2 平板計數測定值

E. coliO157:H7 CICC 21530過夜培養菌液經10 倍梯度稀釋后，進行平板計數，測得原始菌液濃度為2.0×109CFU/mL，即菌落數為9.30（lg（CFU/mL））。

2.2.3 ddPCR測定值及3 種檢測方法測定值對比

ddPCR在10－2稀釋度達到檢測上限，陽性微滴的比率達100%，10－3～10－7稀釋度菌液的測定值結果變異系數（coefficient of variation，CV）均小于20%（表4），根據10－3～10－7稀釋度菌液的ddPCR結果計算出原菌液中E. coliO157:H7菌落數在8.93～9.11（lg（CFU/mL））范圍內（表4）。ddPCR定量限為105 CFU/mL（相當于4.2 拷貝數/反應），檢出限為25 CFU/mL（相當于1 拷貝/反應）（圖2、表4）。

表4 梯度稀釋的E. coollii O157:H7 CICC 21530純菌液ddPCR定量檢測結果Table 4 ddPCR quantitative results of gradient dilutions of pure E. ccoollii O157:H7 CICC 21530 culture

圖2 梯度稀釋的E. ccoollii O157:H7 CICC 21530純菌液的ddPCR擴增微滴分布Fig. 2 ddPCR microdroplet distribution of gradient dilutions of pure E. coli O157:H7 CICC 21530 culture

圖3 梯度稀釋的E. ccoollii O157:H7 CICC 21530純菌液的real-time PCR擴增圖譜Fig. 3 Real-time PCR ampli fication patterns of gradient dilutions of pure E. coli O157:H7 CICC 21530 culture

對各稀釋度菌液提取到的DNA同時進行real-time PCR和ddPCR檢測，結果發現兩者均可檢測到10－7稀釋度（圖2、3）。real-time PCR在10－1～10－7稀釋度范圍內檢測結果呈良好的線性關系（Y=－3.54X+36.91，R2=0.999 8），標準曲線斜率－3.54。ddPCR在測定值范圍（10－3～10－7稀釋度）內的檢測結果具有高度一致性，不同稀釋度菌液計算出原菌液中目標菌lg值的CV僅0.9%，平均值為9.01（lg（CFU/mL）），比real-time PCR和平板計數法測定值分別低0.76、0.29（lg（CFU/mL））（圖4）。

圖4 E. ccoollii O157:H7 CICC 21530純菌液中基因組濃度測定值比較Fig. 4 Comparison of measured genomic DNA concentrations of gradient dilutions of E. coli O157:H7 CICC 21530 culture

2.3 人工污染三文魚樣品的3 種檢測方法測定值及分析

2.3.1 平板計數測定值

表5 人工污染三文魚樣品中E. coli O157:H7 CICC 21530的ddPCR、real-time PCR測定值及平板計數結果Table 5 ddPCR, real-time PCR and plate counting results of E. coli O157:H7 CICC 21530 in artifificially contaminated salmon samples

對各個添加水平的人工污染三文魚樣品分別梯度稀釋進行平板計數，根據平板計數結果，10－3～10－7菌液污染樣品中目標菌E. coliCICC 21530菌落數測定結果分別為1 126 667、85 667、9 000、980、130 CFU/g（表5）。

2.3.2 real-time PCR測定值結果

在進行real-time PCR時，以10 倍梯度稀釋的CICC 21530基因組DNA（經超微量分光光度計測定其原液濃度為1.19×108拷貝數/μL）作為標準品，同人工污染樣品中提取的DNA一起進行擴增檢測。結果發現5 個不同污染水平（10－3～10－7）的三文魚樣品均呈陽性擴增，real-time PCR擴增曲線如圖5所示，根據檢測Ct值和得到的標準曲線計算污染樣品中E. coliO157:H7平均含量分別為4 933 333、613 333、48 667、7 233、575 CFU/g（表5）。

圖5 人工污染三文魚樣品real-time PCR檢測擴增曲線圖Fig. 5 Real-time PCR ampli fication curves of arti ficially contaminated salmon samples

2.3.3 ddPCR測定值結果及3 種定量檢測方法比較分析

圖6 人工污染三文魚樣品的ddPCR擴增微滴分布Fig. 6 ddPCR microdroplet distribution of arti ficially contaminated salmon samples

圖6 顯示，隨著污染水平的下降，出現的陽性微滴數量逐漸減少，根據陽性微滴數量和泊松分布原理，由QuantaSoft軟件測定并根據計算得到E. coliCICC 21530菌落數分別為917 000、80 200、8 330、943、110 CFU/g（表5）。總體而言，real-time PCR和ddPCR的測定結果同平板計數測定值間均存在良好的相關性，但是realtime PCR的測定值結果明顯高于ddPCR及平板計數測定值。t檢驗結果表明ddPCR和平板計數兩種方法對稀釋度10－4～10－7菌液污染樣品的定量結果均無顯著性差異（P＞0.05，表5）；在10－3～10－7菌液污染水平上，realtime PCR的測定結果明顯偏高，與ddPCR測定值結果和平板計數均有顯著性差異（P＜0.05，表5）。可見ddPCR對于人工污染樣品的測定結果更加準確，在不經增菌培養的條件下，其檢出限為110 CFU/g。

2.4 重復性分析

針對E. coliCICC 21530純培養液和人工污染三文魚的ddPCR檢測結果均可用來分析整體檢測的重復性。由表4和表5可見，在整個定量檢測有效動態范圍內，針對E. coliCICC 21530hlyA基因的測定結果CV均小于20%，證明該方法用于E. coliCICC 21530定量檢測時具有良好的重復性[27]。而且在對人工污染三文魚樣品的檢測中，ddPCR定量結果的CV普遍小于real-time PCR，說明ddPCR具有更好的定量重復性，特別是對于低污染水平樣品這種優勢更加明顯（表5）。

3 討論與結論

國內外已有應用ddPCR技術定量檢測致病菌的相關研究，但食品基質多富含蛋白、脂肪、果膠等核酸擴增抑制成分，背景菌構成復雜且濃度較高，因此，對食品基質中食源性致病菌的定量檢測研究尚不多見。董蓮華等[3]以E. coliO157:H7的rfbE基因為靶基因，建立了可對其準確定量的ddPCR方法。Verhaegen等[28]比較ddPCR及real-time PCR方法定量檢測牛糞中產志賀毒素E. coli得出，在不依賴標準品的情況下，ddPCR方法相對realtime PCR在農場絕對定量檢測產志賀毒素E. coli中有優勢。周巍等[29]以金黃色葡萄球菌nuc基因為靶標基因，建立了發酵乳中ddPCR技術定量檢測金黃色葡萄球菌的方法。方佩佩等[30]采用ddPCR技術建立副溶血性弧菌快速定量檢測，以鱈魚為樣品進行陽性添加，研究表明ddPCR定量檢測技術特異性良好、靈敏度高、結果準確。Gobert等[31]研究表明ddPCR對較低數量的活細胞的定量效果最好，ddPCR在干擾菌背景下，無需建立標準曲線，就可以對少量活菌細胞進行特異性定量。本研究根據高保守特異性序列設計篩選了一套特異性良好的引物探針，利用純菌液檢測建立食品中E. coliO157:H7的ddPCR快速定量檢測技術，通過人工污染食品樣品的檢測驗證該方法的實際應用性。通過純菌液及人工污染樣品檢測的ddPCR定量結果與平板計數及real-time PCR的定量結果的特異性、靈敏度和重復性比較，認為建立的ddPCR技術可以應用到實際食品的定量檢測中。

本研究結果顯示平板計數定量結果與ddPCR定量結果接近，real-time PCR定量結果偏高。ddPCR屬于絕對定量，具有無需標準物質、無需標準曲線、不受PCR擴增效率影響、對PCR抑制劑不敏感等特點，real-time PCR屬于相對定量，結果的準確性和重復性在很大程度上依賴于所繪制的標準曲線質量及擴增效率。目前沒有官方權威機構可以提供具有明確量值（即核酸拷貝數或質量濃度）的E. coli O157:H7核酸標準品，本研究采用超微量分光光度計測量核酸分子在260 nm波長處吸光度，根據1.3.2.1節公式計算定量值，建立標準曲線。標準品/樣品基質中其他DNA或RNA分子以及蛋白等雜質成分可能會影響測定結果，樣品中也可能存在核酸擴增抑制成分導致擴增效率的差異，導致real-time PCR定量結果偏高。

本研究建立的ddPCR檢測技術的定量限為105 CFU/mL（相當于4.2 拷貝數/反應），檢出限為25 CFU/mL，人工污染食品樣品檢出限為110 CFU/g，適用于食品中高污染E. coli O157:H7的定量檢測應用。現行標準GB 4789.36—2016檢測周期為3～5 d，本研究建立的檢測方法從提取DNA到ddPCR檢測僅需1 d，大幅縮短檢測周期，為E. coli O157:H7的防控和監管工作提供技術支持，對食品安全檢測、開展風險評估、突發公共衛生事件應急檢測、控制疫情擴散、提高病原菌檢出效率等均有重要意義[32]。

本研究的目標菌液是經過18 h搖菌培養后細菌活性較好的對數期菌液，但是不能保證菌液中沒有死菌體，即游離DNA，ddPCR屬于分子檢測手段，本實驗使用的DNA提取試劑盒并不能有效去除死菌體的DNA，暫時不清楚是否會對實驗結果產生決定性影響。選取添加的食品基質是經過篩選的未含有目標菌的三文魚水產品，但食品類別豐富，基質復雜多樣，尤其部分生食食品還可能有多種近源微生物干擾，故提取DNA前有效去除菌液中的游離DNA，進一步降低定量限，擴大檢測對象，針對多種食品基質的ddPCR定量檢測為以后研究的方向及重點。