快速濾過型凈化法結合氣相色譜-四極桿-飛行時間質譜同時篩查果蔬中234種農藥殘留

孟志娟，黃云霞，邸鵬月，趙麗敏，牛立沙，范素芳*，李 強*，張 巖

（河北省食品檢驗研究院 河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091）

農藥在保護農作物生長、提高農作物產量和保障農產品儲存質量等方面起到了至關重要的作用。但同時農藥殘留對食品安全、生態環境和人體健康的影響也不可避免。隨著農藥品種增多，多種農藥的混合使用和濫用致使農產品中多種農藥殘留現象比較突出。農藥殘留問題已經成為國際共同關注的食品安全重大問題之一，許多國家和國際性組織（如美國、日本、中國、歐盟和韓國等）針對農產品中農藥殘留的污染現狀制定了農藥最大殘留限量標準，有些農藥化合物限量水平低至10 μg/kg，并呈現逐年嚴格的趨勢[1]。這些標準的實施加強了農藥的監管力度，明確其種類和含量水平保證了農藥的規范化使用、保障了農產品安全和避免了貿易糾紛。但與此同時，如此繁多的農藥最大殘留限量法規對農藥殘留的監控提出了新的難題，因此采用先進的分析技術測定農產品中多種農藥殘留同時還要避免由多種不同食品基質造成的基質干擾顯得尤為重要[2-4]。

目前，在進行農藥殘留檢測時，樣品前處理方法有固相萃取法[5]、凝膠滲透色譜法[6-7]和QuEChERS法[8]等。其中QuEChERS方法是一種簡單、快速的農藥殘留預處理技術，其原理是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質，從而達到除雜凈化的目的，是美國官方分析化學師協會認證的方法（AOAC 2007.01）和歐洲標準化委員會認證的歐盟標準方法（EN 15662-2008）[9-10]，已廣泛應用于果蔬、小麥粉和人參等的分析中[11-15]。農藥殘留檢測方法主要為氣相色譜（gas chromatography，GC）法[16]、液相色譜（liquid chromatography，LC）法[17-18]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[19-20]和液相色譜-質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[21-23]，其中GC和LC定性能力弱，而GC-MS和LC-MS/MS為低分辨質譜。當樣品基質復雜時，質荷比（m/z）接近的目標物和干擾物不能有效地區分，常出現假陽性而造成誤判。同時在選擇離子掃描（selected ion monitor，SIM）或多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式下，由于儀器掃描速率不高，限制了掃描的化合物數量，無法真正實現高通量篩查。在采用GC-MS和LC-MS/MS分析幾百種農藥時，往往需要把化合物分成幾組進行分別檢測[24-25]，降低了分析速度，而在全掃描模式時，其靈敏度低、分辨率差，不能準確定性[26]。此外，GC-MS和LC-MS/MS的定性分析必須依賴標準物質。而標準物質的配制和使用，增加了實驗成本和分析的工作量。飛行時間質譜（time-of-flight mass spectrometry，TOF-MS）法利用動能相同、m/z不同的離子在恒定電場中運動時，經過恒定距離所需時間不同的原理，對物質成分或結構進行測定，通過與四極桿質量分析器串聯，更大程度地提高定量準確度和線性范圍。其定性能力強和篩查能力高，測定化合物不受數量限制，可采集更為全面的化合物信息，越來越多地應用于多種目標化合物的測定，在污染物痕量分析中優勢突出，已開始廣泛應用[27-30]。TOF-MS還可建立特定化合物數據庫，結合樣品采集的精確質量數、保留時間、同位素比值等信息，通過軟件進行自動檢索和分析確證，從而實現不使用標準品對目標化合物進行快速鑒定[31-32]。近年來，利用氣相色譜-四極桿-飛行時間質譜（gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，GC-QTOF-MS）檢測農藥殘留成為新的研究方向。GC-QTOF-MS同時具有高分辨率和高靈敏度特點，能對復雜基質的低含量水平目標化合物進行篩查和定量分析，目前GC-QTOF-MS已經用于水產品[33]和果蔬[34-35]等農藥殘留研究中。常規的監測項目中涉及農藥化合物幾百種，檢測方法必須能夠一次處理多種化合物，同時還要避免多種基質造成的基質干擾。使用GC-QTOF-MS進行農藥篩查的精確質量數方法確保了農藥鑒定的可靠結果，并能夠對新添加的化合物進行回溯性分析，大大增加了化合物進行同步篩查的數量。快速濾過型凈化（multi-plug filtration cleanup，m-PFC）法是基于QuEChERS方法開發的一種新型快速樣品前處理凈化柱，將多壁碳納米管、乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）和C18固相材料填入柱體管中制成，可實現一步法凈化，從而大大縮短凈化時間，可大幅提高前處理速率和效率，已用于人參、果蔬中多種農藥殘留檢測[36-38]。但以m-PFC凈化結合GCQTOF-MS技術應用于果蔬中多種農藥殘留量的檢測國內外鮮見報道。

本實驗根據目標物的性質，采用基于m-PFC凈化改進的QuEChERS方法，建立了12 種典型果蔬（白菜、芹菜、番茄、黃瓜、菠菜、韭菜、油菜、柑橘、梨、蘋果、葡萄、橙子）基質中234 種農藥的GC-QTOF-MS測定方法。該方法具有檢測速度快、通量高、結果準確可靠的特點，適用于大量樣品中農藥多殘留快速篩查分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果蔬（白菜、芹菜、番茄、黃瓜、菠菜、韭菜、油菜、橘子、梨、蘋果、葡萄、橙子） 市購。

乙腈（色譜純） 德國Merck公司；m-PFC小柱（簡單基質包括150 mg MgSO4、15 mg PSA和15 mg MWCNTs）、m-PFC小柱（復雜基質包括150 mg MgSO4、15 mg PSA和25 mg MWCNTs）、乙酸緩沖鹽體系鹽包（包括6 g MgSO4和1.5 g醋酸鈉） 北京綠綿科技有限公司。

234 種農藥標準品物質購自阿爾塔科技有限公司，以乙腈配制234 種農藥混合標準儲備液，質量濃度均為10 μg/mL，置于－18 ℃冰箱貯存。

1.2 儀器與設備

7200 GC-QTOF MS質譜儀、HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；3K15型高速冷凍離心機 德國Sigma公司；Vortex渦旋混合器德國IKA公司；KQ-250DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；冰箱 中國青島海爾股份有限公司；0.22 μm微孔濾膜 天津艾杰爾公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方式

稱取已均質好的新鮮果蔬樣品15.0 g（精確到0.001 g）于50 mL塑料離心管中，加入15 mL乙腈，充分混勻，超聲10 min，加入乙酸緩沖鹽體系鹽包，渦旋1 min，放入冰水浴中2 min，在9 500 r/min離心3 min。

1.3.2 凈化方式

m-PFC凈化：取上清液2 mL，移入m-PFC小柱上端，緩慢推動注射桿，過0.22 μm有機濾膜后，用氣相小瓶承接流出液，待GC-QTOF-MS進樣分析。

1.3.3 標準溶液的配制

用基質空白提取液稀釋234 種農藥混合標準儲備液，配制質量濃度分別為0.005、0.02、0.05、0.1、0.5 μg/mL的系列標準溶液。基質混合標準溶液應現配現用。

1.3.4 加標回收實驗

采用1.3.1節和1.3.2節中樣品提取和凈化方式，對12 種果蔬基質（白菜、芹菜、番茄、黃瓜、菠菜、韭菜、油菜、柑橘、梨、蘋果、葡萄、橙子）234 種農藥進行回收率添加實驗，添加量分別為10、50、100 μg/kg，在選定的色譜-質譜條件下上機測定，每個水平重復6 次。

1.3.5 儀器條件

1.3.5.1 色譜條件

HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度：280 ℃；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以40 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至310 ℃；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；流速：0.935 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：2 μL。

1.3.5.2 質譜條件

離子化模式：電子電離源；電子能量：70 eV；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：300 ℃；采集模式：TOFScan全掃描；一級質量數掃描范圍：m/z50～550，采集速率2 spectrum/s；溶劑延遲：4 min；安捷倫MassHunter工作軟件。

1.4 數據庫的建立

在優化色譜條件下進樣，對234 種化合物進行一級質譜全掃描，在定性軟件中設置譜庫檢索及標注分子式參數，通過積分并查找化合物找到目標化合物，將檢索結果并標注分子式的結果發送至PCDL庫。通過在PCDL據庫軟件中輸入每種農藥的名稱、保留時間、分子式、精確相對分子質量、CAS號，建立234 種化合物的一級精確質量數PCDL庫，見表1。

表1 234 種化合物的保留時間、碎片離子和精確質量數Table 1 Retention times, fragment ions and accurate masses of 234 pesticides

續表1

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2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

依據國家相關標準中涉及的農藥目錄，結合我國果蔬種植常用農藥種類，選擇234 種適合GC分析農藥作為目標分析化合物，包含了大多數農藥，包含有機磷類、有機氯類、擬除蟲菊酯類、苯氧羧酸類、三唑類和酰胺類農藥，種類多且極性差異較大，因此選擇合適的提取溶劑尤為重要。采用甲醇為溶劑時，提取的色素少，但回收率為0%～56%。采用乙酸乙酯提取，有些有機磷農藥如七氯，回收率小于70%。傳統的QuEChERS采用乙腈為提取溶劑，乙腈的溶解性好、滲透力強，適合提取的農藥極性范圍廣，對大多數農藥的提取效率高。本實驗考察了加入氯化鈉和乙酸緩沖鹽包對234 種化合物的提取效率的影響，以在蘋果基質中添 加量為50 μg/kg的回收率作為考察指標。結果顯示，加入氯化鈉，一些穩定性差的農藥回收率低，農藥回收率在70%～120%之間的有183 種，其結果與基質的pH值有關，加入乙酸緩沖鹽后農藥如百菌清回收率從75%提高到86%，敵敵畏回收率由55%提高到75%，甲胺磷回收率從73%提高到89%，所有農藥的回收率均在70%～120%之間，滿足檢測要求。樣品中加入乙酸緩沖鹽形成的緩沖體系使基質pH值在整個實驗過程中保持在5.0～6.0之間，該體系能有效防止對酸堿敏感農藥的降解，適合于多種果蔬基質。由于本實驗涉及的農藥種類較多，因此本實驗選擇乙腈作為提取溶劑，加乙酸緩沖鹽包調節pH值。乙酸緩沖鹽體系鹽包中含有無水MgSO4，在提取過程中吸水會大量放熱，有些有機磷（如甲胺磷、對硫磷和殺螟硫磷等）農藥化學性質不穩定，高溫易分解，回收率小于70%，而放入冰水浴中，這些化合物回收率大于75%，滿足要求。因而在加入乙酸緩沖鹽體系鹽包后把提取樣品的離心管迅速放入冰水浴中2 min，減少熱穩定性差農藥的回收率。

2.2 凈化條件的選擇

果蔬基質中含有脂類、色素、糖類和有機酸等，這些物質在提取過程中會和目標物一起提出。如果不進一步凈化，目標物會受到干擾而影響定性定量結果。本實驗比較QuEChERS凈化包和m-PFC柱凈化。QuEChERS凈化包起主要作用的PSA、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）和石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）。其中PSA中氨基官能團可與一些酸性基團反應，可以除去極性的有機酸，以及一些糖類和脂類；C18是一種多孔吸附劑，起非極性的物理吸附作用，可以用來去除脂類和固醇。但PSA和C18對色素的凈化效果均不能達到要求。GCB能夠對果蔬中葉綠素及極性小分子干擾物質有很好的吸附效果，但是GCB非常容易吸附平面結構的目標物，如擬蟲菊酯類農藥有很強吸附性導致目標物回收率偏低。m-PFC柱中除PSA外，還添加了一定量的MWCNTs。MWCNTs是 一種新型納米材料，具有極高的強度、極大的韌性和較大的比表面積，對色素、脂肪等干擾物質有特殊的選擇性。該材料為管狀結構，具有獨特的理化性能，吸附性能與GCB不同，機械強度高、耐酸、堿能力強，具有更強的吸附和凈化能力。以韭菜樣品為例，當添加量為50 μg/kg時，采用m-PFC柱凈化和QuEChERS凈化包凈化，分別對234 種農藥回收率進行檢測。通過比較可以看出：采用m-PFC柱凈化回收率在70%～120%之間的農藥大于QuEChERS凈化包凈化，見表2。采用m-PFC柱凈化，所有農藥回收率在73.2%～122.4%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）低于10.8%；采用QuEChERS凈化包凈化，所有農藥回收率在63.2%～123.5%之間，RSD低于12.4%。2 種方法的回收率有差異，主要是QuEChERS凈化包GCB中吸附作用，所以m-PFC柱凈化較QuEChERS凈化包凈化效率高且對目標物回收率基本無影響。對于色素嚴重的復雜基質（如韭 菜、菠菜、油菜等），采用m-PFC小柱（復雜基質），和m-PFC小柱（簡單基質）相比，將15 mg MWCNTs調整為25 mg MWCNTs，其他材料未變，凈化效果更好，所有農藥回收率在72.8%～121.3%之間，RSD小于10.4%，回收率能滿足篩查要求且和m-PFC小柱（簡單基質）無太大差別，但能降低對分析儀器的污染和損害。實驗表明，一定量PSA和MWCNTs的配合使用能有效避免基質中雜質的干擾，提高目標物的回收率。同時m-PFC法凈化對每個樣品的前處理時間可控制在10 min以內，而QuEChERS凈化包凈化還需要移取上清液后再次離心，每個樣品的前處理時間較長。由此可見，m-PFC法可以在較短的時間內準確完成果蔬樣品中農藥殘留的提取凈化工作，可大幅度提高前處理速率和效率。所以本實驗選擇m-PFC柱凈化。

表2 韭菜中234 種農藥在不同凈化方法時的加標回收率（50 μg kg）Table 2 Recoveries of 234 pesticides in spiked Chinese leek samples cleaned up by different purifification methods (50 μg kg)

2.3 定性篩查及確證

應用表1建立的譜庫進行檢索時，化合物的精確質量數偏差、保留時間偏差、同位素分布和同位素豐度比是影響定性判定的主要因素。根據歐盟SANTE/11945/2015[39]，使用高分辨質譜確證時，至少需1 個精 確質量數的離子和1 個碎片離子。

定性軟件中調用創建的PCDL精確質量數據庫進行目標化合物的檢索，檢索參數如下：質量提取窗口25×10－6，質量偏差5×10－6；保留時間提取窗口0.40 min，保留時間偏差0.15 min；信噪比3；匹配要求：離子信息3 個；共流出比較：0.15 min。根據檢索的參數進行打分，檢出離子的得分平均值即為該化合物的綜合得分，規定化合物的得分大于60且至少3 個離子檢出，判別該化合物為陽性。應用本研究建立的譜庫，234 種目標化合物均能被準確確證。蘋果基質樣品234 種的總離子流圖（圖1a），蘊含著豐富的化學信息，但看不出目標物的色譜峰；蘋果基質樣品的提取離子流圖（圖1b），能夠很明顯看出蘋果基質添加234 種目標物的色譜峰，定性和定量分析軟件就是根據該信息進行分析，從而達到確認目標物和準確定量的目的。說明GC-QTOF-MS能夠從復雜基質中提取有用的信息，其在高通量篩查中具有優勢。

圖1 蘋果基質中添加量為5500 μgg/kg 234 種農藥的總離子流圖（a）和提取離子流圖（bb）Fig. 1 Total ion current chromatogram (a) and extracted ion chromatograms (b) of 234 pesticides spiked into apple matrix at 50 μg/kg

2.4 基質效應

采用GC-MS法時，基質效應（matrix effect，ME）一般歸因于目標物經由熱進樣口向色譜柱傳輸過程中由于基質的參與，減少了熱不穩定目標物的分解，或者由于基質屏蔽了進樣口的活性位點，從而減少了極性目標物被活性位點吸附，從而影響成分復雜樣品定性定量分析結果的重現性和準確度。ME評價方法：ME/%=B/A×100，A為在純溶劑中農藥目標物的信號峰面積，B為在樣品基質液中添加相同含量的目標物信號峰面積，ME在70%以下認為存在基質抑制效應，在80%～120%之間則認為ME不明顯，在120%以上認為存在強基質增強效應[40]。本實驗考察12 種典型果蔬樣品（白菜、芹菜、番茄、黃瓜、菠菜、韭菜、油菜、柑橘、梨、蘋果、葡萄、橙子）的ME，其中聯苯菊酯、氰戊菊酯和嘧菌酯在柑橘、橙子、韭 菜和菠菜的ME大于120%，表現為基質增強效應；在其余的8 種基質中為80%～120%之間，ME不明顯。氟氰戊菊酯、溴螨酯、腈菌唑和蟲螨腈在芹菜和黃瓜的ME大于120%，表現為基質增強效應；在其余的10 種基質ME在80%～120%之間，ME不明顯。其他化合物在12 種基質中ME在80%～120%之間，ME不明顯。234 種目標物在12 種基質中無基質抑制效應。因此本實驗采用空白基質溶液配制標準曲線法進行定量抵消ME的影響，這樣不僅前處理步驟簡單，定量更準確。

2.5 線性范圍、檢出限和回收率

以12 種典型基質（白菜、芹菜、番茄、黃瓜、菠菜、韭菜、油菜、柑橘、梨、蘋果、葡萄、橙子）進行分析，配制空白基質標準曲線溶液為0.005、0.02、0.05、0.1、0.5 μg/mL，以化合物的相應含量（X）為橫坐標，對應峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。各目標化合物在5～500 μg/kg范圍的線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.990。采用空白樣品添加的方式考察方法中234 種農藥的檢出限均在5～20.0 μg/kg之間，符合多數農藥殘留的分析要求。為考察方法的準確性，分別在陰性樣品基質中添加234 種化合物的混合標準溶液，添加量分別為10、50、100 μg/kg，在優化的條件下進行測定，每個添加水平做6 個平行實驗。結果顯示，234 種化合物在3 個添加水平下12 種典型果蔬樣品的平均加標回收率分別為73.2%～124.8%、75.5%～122.6%和74.8%～121.7%，平均RSD分別為2.4%～13.2%、2.8%～11.4%和2.2%～10.5%。表明該方法回收率和精密度滿足國家標準關于農藥殘留檢測方法要求[41]，其中韭菜和蘋果基質中234 種化合物的相關系數、檢出限、平均加標回收率和平均RSD見表3。

2.6 實際樣品的測定結果

用1.3節樣品前處理方法，對市售的200 例樣品（白菜、芹菜、番茄、黃瓜、菠菜、韭菜、油菜、柑橘、梨、蘋果、葡萄、橙子）進行檢測，其中158 例樣品檢出農藥殘留，其中芹菜、韭菜、菠菜、葡萄、柑橘等樣品的檢出率較高；農藥檢出率較高的為毒死蜱、苯醚甲環唑、腐霉利、聯苯菊酯、甲霜靈、蟲螨腈、抑霉唑、噠螨靈、二甲戊靈、丙溴磷、乙螨唑、戊唑醇化合物。其中韭菜樣品中有4 批毒死蜱和腐霉利超出食品中農藥最大殘留限量；芹菜樣品中有2 批毒死蜱超出食品中農藥最大殘留限量；柑橘樣品中3 個批次丙溴磷和抑霉唑超過食品中農藥最大殘留限量；其余化合物均未超過食品中農藥最大殘留限量[41]。蘋果中毒死蜱提取離子流圖（圖2a），3 個碎片離子能夠確認毒死蜱，且保留時間和 PCDL庫中接近。毒死蜱標準物質（圖2b）和蘋果樣品中毒死蜱（圖2c）的質譜圖顯示，其質量誤差、碎片離子分子式和相對離子豐度進一步確認了蘋果中毒死蜱存在。經過實際樣品的驗證，該方法也適用于草莓、桃、西蘭花、金針菇等果蔬中234 種農藥殘留的檢測，同時也為果蔬中農藥殘留測定提供了靶向性和針對性。

表3 韭菜和蘋果中234 種農藥的相關系數、檢出限、加標回收率和相對標準偏差（ =6）Table 3 Correlation coeffificients (R2 ) , limits of detection, spiked recoveries and RSDs of 234 pesticides in Chinese leek and apple ( = 6)

續表3

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圖2 蘋果樣品中毒死蜱提取離子色譜對應的碎片離子響應值（aa）、毒死蜱標準物質譜圖（b）和蘋果樣品中毒死蜱譜圖（cc）Fig. 2 Extracted ion chromatograms of chlorpyrifos in apple sample (a),mass spectrum of chlorpyrifos standards (b) and mass spectrum of chlorpyrifos in apple sample (c)

2.7 回溯性分析

GC-QTOF-MS常采集全譜，能夠更全面地采集數據，數據采集與PCDL庫中的化合物數目無關，因此采集完成可對數據進行回顧與重新分析，擴大目標范圍。分析樣品時把新的化合物戊菌唑保留時間、分子式、精確相對分子質量和CAS號等信息加入到234 種PCDL庫中并采用實際樣品進行驗證，該化合物在各基質中線性大于0.990，在3 個添加水平（10、50、100 μg/kg）下的平均加標回收率為80.2%～120.4%，平均RSD為2.8%～10.1%，均滿足檢測相關要求。實際樣品中3 例葡萄樣品檢出戊菌唑，檢出量范圍為0.052～0.15 mg/kg，未超過食品中農藥最大殘留限量。該方法可對目標化合物進行擴充和分析而不用重新采集實時數據，具有靈活性，便于農藥殘留高通量篩查和定量分析，是未來農產品風險監測技術的發展方向。

3 結 論

本實驗建立了基于m-PFC柱凈化，采用GC-QTOFMS快速測定果蔬中234 種農藥殘留的分析方法。m-PFC柱凈化比傳統QuEChERS前處理操作簡便高效，能夠有效降低復雜基質的干擾；GC-QTOF-MS通過保留時間、精確分子質量及定量離子與定性離子比率等信息進行定性分析，重復性好和準確度高，避免了假陽性和假陰性的出現。同時，GC-QTOF-MS采集全譜，可以對數據進行回顧和重新分析，擴展農藥化合物篩查分析范圍。該方法大大提高了檢測的效率和檢測的準確度，能夠對農藥多殘留進行高通量快速篩查和定量，為果蔬中多種農藥殘留的風險監測提供了一種有力的技術手段。