廊坊地區(qū)MTHFR C677T基因多態(tài)性和孕期不同階段血清HCY水平的相關(guān)性研究

邢煥霞 付敏 鄭勝俠 楊琦 韓玉成

隨著人類基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究的深入，現(xiàn)已證實(shí)葉酸代謝相關(guān)的孕期、圍產(chǎn)期合并癥如胎盤早剝、妊娠高血壓綜合征、早產(chǎn)、流產(chǎn)等的發(fā)生和出生缺陷如神經(jīng)管缺陷、非綜合征性唇腭裂、先天性心臟病、唐氏綜合癥等并不是和葉酸缺乏直接相關(guān)，而是和血漿中同型半胱氨酸(HCY)不能正常代謝，在血漿中過(guò)量蓄積有密切聯(lián)系[1-5]。有研究顯示高HCY 水平刺激血管平滑肌細(xì)胞增生，使血管內(nèi)皮損傷和功能異常，破壞機(jī)體凝血和纖溶系統(tǒng)，進(jìn)而引起妊娠期合并癥一系列癥狀產(chǎn)生[6]。文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)流行病學(xué)顯示有過(guò)唐氏綜合癥、神經(jīng)管畸形和先天性心臟病等病史的母親，以及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和妊娠高血壓綜合征的孕婦體內(nèi)HCY 水平較高[7,8]。國(guó)內(nèi)外研究中證實(shí)在動(dòng)物模型試驗(yàn)中高HCY 血癥能激發(fā)胚胎細(xì)胞過(guò)度凋亡，抑制胚胎細(xì)胞合成遺傳物質(zhì)DNA 和RNA，細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期HCY高水平可造成染色體不分離等，導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)發(fā)育畸形，嚴(yán)重者引起早期胚胎死亡[9,10]。20世紀(jì) 90年代初，研究發(fā)現(xiàn)生育過(guò)神經(jīng)管缺陷(NTDs)的孕婦HCY 水平明顯高于對(duì)照組,隨后越來(lái)越多的研究證明 HCY代謝異常在 NTDs、妊娠高血壓等疾病的發(fā)生上扮演著重要角色。西方學(xué)者將HCY稱為“邪惡氨基酸”，它是一種含硫氨基酸，屬于蛋氨酸和半胱氨酸代謝循環(huán)中的中間代謝產(chǎn)物,HCY 代謝主要有兩條途徑，若與這兩條途徑相關(guān)的酶或因子的基因突變，可引起 HCY水平升高，HCY水平升高后將產(chǎn)生大量自由基和過(guò)氧化氫，從而損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，因此成為NTDs、妊娠高血壓等疾病發(fā)生的高危風(fēng)險(xiǎn)因素。HCY水平還受遺傳因素、膳食營(yíng)養(yǎng)因素、疾病、年齡等因素影響[11]，喬福元等[11]研究指出孕早期HCY水平可作為妊娠高血壓預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，孕中期HCY水平可作為診斷早期妊娠高血壓的重要指標(biāo)。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是Hcy代謝關(guān)鍵酶，突變的677堿基C/T使基因頻率多態(tài)化，從而使酶活性下降，可引起Hcy的蓄積。本文擬通過(guò)檢測(cè)孕期不同階段HCY水平和MTHFR基因頻率，分析孕期不同階段及產(chǎn)后42 d HCY變化與遺傳因素的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院產(chǎn)前診斷中心2016年5月至2019年6月進(jìn)行孕期檢查的漢族女性，入組人群系廊坊地區(qū)居民，排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)籍貫非本省本地區(qū)者；(2)患有甲狀腺疾病、冠心病、惡性腫瘤、糖尿病、免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病者；(3)肝腎功能不全者、曾行腸胃切除手術(shù)或患嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病者。入組對(duì)象922例漢族女性，平均年齡(25.46±3.52)歲。

1.2 方法 利用中國(guó)疾病預(yù)防控制中心婦幼保健中心指定的采樣拭采集的受檢者口腔黏膜細(xì)胞，提取受檢者DNA樣本使用柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒。采用 Taqman-MGB 技 術(shù) 對(duì)MTHFR 基因 C677T、A1298C位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型進(jìn)行檢測(cè)。探針序列如下：MTHFR A1298C：5’-AAGAACGAAGACTTCAAAGACACTT[G/T] CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCCCCA-3’；MTHFR C677T:3’-GAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG[G/A]CTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA-3’。在每個(gè)10 μl反應(yīng)體系中包含：2 x Taqman Universal MasterMix 5 μl， 20 ng/μl DNA模板 1 μl，去離子水 3.5 μl，20 x Taqman-MGB探針0.5 μl。反應(yīng)條件設(shè)置：95℃下反應(yīng)10 min，92℃下反應(yīng)15 s，60℃ 下反應(yīng)1 min擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，89℃下反應(yīng)15 s，60℃下反應(yīng)90 s 擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，利用ABI 7500型的熒光定量PCR檢測(cè)儀讀取終點(diǎn)熒光，利用相關(guān)分析軟件分析并確定搜集樣本的基因型結(jié)果。研究中的相關(guān)儀器、試劑購(gòu)于美國(guó)ABI公司。在孕期第10～14周、第24～28周、第32～36周和產(chǎn)后42 d采集孕早期、孕中期和孕晚期入組對(duì)象的血樣，使用儀器為貝克曼公司全自動(dòng)生化免疫分析儀AU680，采用酶法檢測(cè)血清HCY濃度，試劑購(gòu)自艾威德(北京)醫(yī)療科技有限公司。

2 結(jié)果

2.1 基因型及等位基因與其他地區(qū)漢族女性比較 選取已報(bào)道的地區(qū)級(jí)地區(qū)人群數(shù)據(jù)，與本地區(qū)人群MTHFR基因遺傳多態(tài)性頻率分布情況進(jìn)行比較。廊坊地區(qū)的漢族女性MTHFR 677TT基因型頻率為33.5%，顯著低于淄博等地人群(P<0.05)，與尚志、長(zhǎng)春等地?cái)?shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MTHFR 1298CC基因型頻率為2.0%，與尚志、烏魯木齊、長(zhǎng)春等地?cái)?shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與眉山、長(zhǎng)沙等地?cái)?shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、2。

表1 不同地區(qū)漢族女性 MTHFR 基因型頻數(shù)和頻率比較[12-21] 例(%)

表2 不同地區(qū)漢族女性MTHFR等位基因頻數(shù)和頻率分布比較 例(%)

2.2 基因位點(diǎn)連鎖情況分析 最常見的組合是CT/AA (33.2%),TT/AA (33.3%)，少見的組合是TT/AC(0.2%)，未發(fā)現(xiàn)TT/CC和CT/CC組合。從組合中可以看出，MTHFR其中一個(gè)位點(diǎn)突變時(shí)，另一個(gè)位點(diǎn)突變的概率會(huì)降低。見表3。

表3 MTHFR C677T和A1298C連鎖型分布 例(%)

2.3 不同基因型對(duì)應(yīng)的孕期不同階段HCY水平分析 MTHFR C677T位點(diǎn)三種基因型HCY水平均值依次為 CC組3.84 μmol/L，CT組3.85 μmol/L，TT組3.85 μmol/L，經(jīng)單因素方差分析組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。孕期不同階段HCY水平組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同基因型對(duì)應(yīng)的孕期血清HCY濃度比較

2.4 不同基因型對(duì)應(yīng)的產(chǎn)后42 d HCY水平 從入組人群中選取192位前來(lái)我院做產(chǎn)后42 d檢查女性，比較該組人群孕期和產(chǎn)后42 d HCY水平，結(jié)果表明產(chǎn)后42 d組HCY水平顯著高于孕期(P<0.05)，MTHFR C677T三種基因型對(duì)產(chǎn)后42 d HCY水平比較，TT型較CC型和CT型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 不同基因型對(duì)應(yīng)的產(chǎn)后42 d血清HCY濃度比較

3 討論

本研究對(duì)廊坊地區(qū)孕期女性MTHFR C677T基因頻率研究，得到CC型、CT型、TT型的頻率分別為16.8%、49.7%、33.5%，與2014年報(bào)道本地區(qū)TT基因頻率無(wú)顯著性差異[22]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) MTHFR C677T 基因頻率與孕期不同階段HCY水平無(wú)顯著性差異，與產(chǎn)后42 d高HCY水平存在關(guān)聯(lián)，MTHFR C677T TT型較CC型和CT型HCY水平有顯著升高，這一研究結(jié)論與勞海紅等[23]研究結(jié)論不一致。多項(xiàng)研究中證實(shí)MTHFR C677T基因頻率多態(tài)性具有地域、種族差異性[24]。復(fù)旦大學(xué)方綺雯等[25]研究測(cè)定了上海地區(qū)1 000例孕婦的MTHFR C677T基因多態(tài)性與HCY水平，結(jié)果中顯示攜帶T等位基因孕婦是高同型半胱氨酸血癥的危險(xiǎn)因素。本研究對(duì)孕期不同階段同型半胱氨酸值做了測(cè)定，缺乏孕前期數(shù)據(jù)， HCY變化還需要檢測(cè)孕前數(shù)據(jù)，以便更準(zhǔn)確分析整個(gè)孕期HCY數(shù)值變化情況。

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)，它在第一號(hào)染色體1p36.3上，全長(zhǎng)20.374 kb。MTHFR是Hcy循環(huán)中葉酸代謝關(guān)鍵酶，外源性葉酸經(jīng)人體吸收轉(zhuǎn)化為四氫葉酸，經(jīng)MTHFR催化下形成有活性的N5-四氫葉酸，繼續(xù)在甲硫氨酸合成酶(MS)催化葉酸、維生素B12輔酶作用下使HCY甲基化代謝為甲硫氨酸。甲硫氨酸在ATP作用下轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。而SAM可在體內(nèi)生化反應(yīng)中提供甲基用于蛋白質(zhì)及DNA的甲基化。

葉酸是同型半光氨酸代謝途徑中的必須因子，缺乏或代謝異常可導(dǎo)致DNA合成或半胱氨酸代謝途徑受阻，蓄積導(dǎo)致高半胱氨酸血癥。

MTHFR 677堿基C/T基因頻率多態(tài)化，使酶活性下降，導(dǎo)致同型半光氨酸代謝途徑中斷，血液循環(huán)中同型半胱氨酸蓄積濃度升高，引起連鎖生物反應(yīng)。研究表明同型半胱氨酸蓄積，人體內(nèi)生化反應(yīng)甲基化不足，造成染色體分離不全，引起多種胎兒畸形及后續(xù)重要生物活性物質(zhì)合成障礙；高同型半胱氨酸水平給胚胎神經(jīng)系統(tǒng)造成不可逆損害，導(dǎo)致神經(jīng)管缺陷(NTDs)如無(wú)腦、脊柱裂等損害；高同型半胱氨酸水平導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管壁彈性下降及附壁粥樣斑塊鈣化明顯，導(dǎo)致心腦血管疾患風(fēng)險(xiǎn)增加。

HCY是一種含硫氨基酸，它的生物學(xué)效應(yīng)具有多樣性，與多種疾病發(fā)生相關(guān)。同型半胱氨酸是多種妊娠并發(fā)癥的早期診斷、治療依據(jù)之一，如GDM(妊娠糖尿病)、妊娠高血壓綜合征、胎兒生長(zhǎng)受限、低體重兒、出生缺陷如神經(jīng)管缺陷、唐氏綜合征等。高同型半胱氨酸與多囊卵巢綜合征(PCOS)患者高雄激素及胰島素抵抗有密切關(guān)聯(lián)，亦會(huì)影響卵子質(zhì)量及發(fā)育潛能，導(dǎo)致種植率降低、流產(chǎn)率升高[26]。國(guó)內(nèi)外研究對(duì)孕期同型半胱氨酸水平變化與低出生體重、早產(chǎn)、妊娠期高血壓文獻(xiàn)較多，郭燕華等[27]觀察18周內(nèi)孕婦血清HCY水平等因素對(duì)產(chǎn)后胎兒體重、早產(chǎn)結(jié)局的影響，結(jié)果顯示血清HCY水平越高，新生兒體重偏輕的風(fēng)險(xiǎn)越高，早產(chǎn)和子癇前期發(fā)生率也越高。黃華等[28]研究表明孕中期及孕晚期孕婦血清HCY水平升高，其妊娠期高血壓疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，可將血清HCY水平作為評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)妊娠期高血壓疾病的可信指標(biāo)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)廊坊地區(qū)MTHFR C677T基因頻率多態(tài)性變化對(duì)孕期血清同型半胱氨酸水平無(wú)顯著性影響，TT型對(duì)產(chǎn)后42 d血清同型半胱氨酸水平有顯著性影響。同時(shí)多項(xiàng)研究支持高同型半胱氨酸血癥是多種疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[29]，所以針對(duì)不同地區(qū)、不同民族、不同孕期階段展開大規(guī)模MTHFR C677T基因頻率多態(tài)性、血清同型半胱氨酸水平及多種疾患相關(guān)性研究非常必要，可進(jìn)一步降低同型半胱氨酸相關(guān)妊娠疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)，同時(shí)為孕婦提供個(gè)體化的干預(yù)措施。