果膠降解菌的篩選、鑒定及發酵產酶條件優化

姜立春，楊彩萍，陳佩瑤，胡榆琳，何 靜，武炳秀，羅 靜，阮期平

(綿陽師范學院分子生物學與生物制藥重點實驗室，四川綿陽 621006)

0 引言

果膠是一種包含在陸生植物初生細胞壁中的雜多糖，是植物細胞壁的重要組成部分.果膠酶是一系列催化果膠物質的半乳糖醛酸長鏈殘基的糖苷鍵水解酶的總稱，屬于復合酶[1].根據果膠酶對底物作用的不同方式可分為四大類：果膠酯酶、裂解酶、原果膠酶和聚半乳糖醛酸酶[2].果膠酶在生物領域應用較為廣泛.在釀造中，分解植物材料，因此有助于從麥芽中提取香精；由于果膠的存在，致使酒產生煙霧或渾濁，果膠酶可打破這種現狀，使酒澄清；在紡織業中，果膠酶可將果膠分解為低分子的水溶性寡聚物，從而提高紡織材料的吸收性能和白度，避免纖維破壞[3].此外，果膠酶通過分解茶葉中的果膠，用于茶的發酵，以及通過避免乳化作用的形成，而用于油脂萃取果膠酶原生質體融合技術與植物病理學方面[4].

果膠酶可以從微生物(如細菌和真菌等)或植物中的分離獲得[5]，但來源于植物的果膠酶產量低且不容易分離、提取與純化，進而很難大規模生產.目前，微生物已成為生產果膠酶較好的生物資源，包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米根霉(Rhizopusoryzae)、囊酵母(Zygoascussp.)等[6-8]，其中黑曲霉也已成為工業生產果膠酶較為常見的真菌菌株[9]，但果膠酶的產量較小且酶活不理想遠不能滿足國內市場日益增長的需求.為此，選育適合于工業化生產的果膠酶高產菌，是提高我國果膠酶制劑的質量與降低成本的基礎與關鍵.

本試驗旨在通過以果膠作為唯一碳源的選擇性培養基，從腐爛的水果中，篩選出具有較高果膠降解能力的菌株，再通過后續產酶條件優化試驗，獲取高產果膠酶的生產菌株，以期為工業化生產果膠酶提供試驗依據.

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉、蘋果、橘子、柚子的果肉及果皮的腐爛部分.

1.2 培養基

果膠瓊脂培養基[7]：K2HPO41.0 g，MgSO40.5 g，NaNO33.0 g，果膠2.0 g， FeSO4·7H2O 0.01 g，蒸餾水1.0 L，pH5.5，瓊脂20.0 g.

PDA培養基：馬鈴薯200.0 g去皮，切塊煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加葡萄糖20.0 g及瓊脂15.0～20.0 g，溶化后補足水至l.0 L，pH值自然.

液體發酵培養基：K2HPO40.01 g，MgSO40.05 g，NaNO30.3 g，FeSO40.001 g，蔗糖0.5 g，水0.1 L，pH 5.8.

牛肉膏蛋白胨斜面培養基：牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水l.0 L，pH自然，瓊脂15.0～20.0 g.

1.3 試驗方法

1.3.1 分離與純化 稱取大約1.0 g香蕉、蘋果、柚子等水果的果肉及果皮的腐爛部分，置于盛有100 mL無菌水的錐形瓶中，用玻璃棒攪勻，即得10-2菌懸液.繼續稀釋，分別得到10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌懸液.用移液槍吸取0.1～0.2 mL 10-4、10-5、10-6、10-7菌懸液至果膠瓊脂培養基平板，每個稀釋度設3個重復，用無菌涂布器涂抹均勻.然后將所有平板放入28℃恒溫培養箱中倒置培養3～5 d.待菌落長出純化后，對單菌落進行編號.

1.3.2 初篩 分別挑取少許菌苔，點接于果膠瓊脂培養基的平板上，于28℃發酵培養3～5 d.用游標卡尺測量單菌落的直徑(d)，再將配制好的盧戈氏碘液緩緩傾倒于平板上，靜置6 min，倒掉盧戈氏碘液，用生理鹽水進行洗滌，測量其變色圈直徑(D)，計算后者與前者的比值(D/d).

1.3.3 復篩 選擇比值相對較大的菌株，將其接種于PDA斜面培養基上，28℃培養3 d.用接種環從斜面上刮取適量菌株于盛有30 mL液體發酵培養基的250 mL錐形瓶中，于28℃ 150 r/min振蕩培養72 h.將發酵液裝入離心管中，于4℃，3 000 r/min離心5 min，得到的上清液即為粗酶液.測定各菌株的酶活，選取酶活相對較高的菌株進行后續實驗.

1.3.4 酶活測定

(1) D-半乳糖醛酸標準曲線 取10支試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL的半乳糖醛酸標準溶液(濃度為1.0 mg/mL)，再向各管中加蒸餾水至2.0 mL，分別加3.0 mL DNS試劑，沸水浴10 min.將各試管從沸水中取出，用流水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至20 mL.以未加半乳糖醛酸標準溶液的試管為空白對照，于540 nm處測定OD540值.每管設3個平行.以半乳糖醛酸的含量為橫坐標，OD540值為縱坐標，繪制標準曲線.

(2)酶活測定方法 分別取粗酶液0.5 mL于5支試管中，另外再取5支試管，分別加入2.5 mL 1.0%果膠溶液.將其中一支裝有0.5 mL粗酶液的試管置于沸水浴中10 min，滅活(空白對照)，然后將其余下的4支試管和裝有2.5 mL 1.0%果膠溶液的5支試管均置于50℃的恒溫水浴鍋中5 min.然后將酶液(包括滅活的酶液)與果膠溶液混勻，于50℃水浴反應30 min.取1.0 mL反應液于具塞試管中，再加入2.0 mL DNS試劑，接著沸水浴10 min.取出后用流水冷卻至室溫，加蒸餾水至20 mL，搖勻，于4℃ 3 000 r/min離心5 min，再在540 nm處測定OD值.每個反應設3個平行.在此條件下，將1 mL酶液每分鐘水解果膠生成1 μg半乳糖醛酸定義為一個酶活力單位[10].酶活力計算公式：X=(A-A0)×N×3×1 000/K×t,各字母表示的含義，A：酶樣吸光度；A0：酶空白樣吸光度；N：酶液稀釋倍數；3：測定酶活時，取了反應液的1/3；1 000：1mg D-半乳糖醛酸為1 000 μg；K：標準曲線的斜率；t：反應時間.

1.3.5 菌株鑒定

(1) 形態觀察 將篩選出的目的菌株在28℃下培養3～5 d，觀察菌落形態.將已滅菌的PDA培養基倒入無菌平皿，待培養基冷卻凝固后，用無菌鑷子夾取已滅菌的蓋玻片，以45°角插入培養基中(深度約占蓋玻片長度的1/2)，然后用接種環將菌株點接于蓋玻片一側的底部.將平板放入28℃恒溫培養箱中倒置培養3～5 d.觀察時，用鑷子將蓋玻片取出，置于載玻片上，滴加一滴棉藍染色液于蓋玻片上，在顯微鏡下觀察其顯微結構.

(2)分子鑒定

①DNA提取 將目的菌株接種于PDA液體培養基中，28℃搖床振蕩培養72 h.再對發酵液進行離心，棄去上清液，用無菌水洗滌菌絲體，再用無菌濾紙將水分吸干.取100 mg左右的菌絲體于研缽中，加入液氮，將其迅速研磨成粉末狀.采用常規SDS法提取基因組DNA[11]，略有修改，-20℃保存備用.

②PCR擴增 采用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)對其ITS-rDNA區進行擴增.反應體系為：10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22.0μL，2.5 mmol/L dNTP 3.0 μL，5 U/μL Taq DNA酶0.25μL，正反向引物(10 mmol/L ITSl和ITS4)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O補至25μL.擴增反應體系為：95℃預變性2.5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸70 s，共32個循環.循環結束后，于72℃延伸8 min.取1.5 μL PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，陽性擴增子送至成都擎科生物技術公司測序.

③生物信息學分析 將測得的序列在NCBI數據庫使用BLAST軟件進行比較，使用默認設置查找最相似的序列，并按E分數排序.用CLUSTAL X排列最相似的代表序列，并用默認設置進行多重比對.然后通過MEGA 7.0軟件，構建出系統進化樹.構建采用鄰位相連法，Bootstrap采用P-distance，隨機種子數1 000.

1.3.6 發酵產酶優化試驗 初始培養條件為：溫度30 ℃，時間60 h，初始pH為6.0，搖床轉速150 r/min，接種量2%(v/v)，裝液量80 mL/250 mL.通過單因素試驗考察了發酵時間、碳源、氮源、初始pH、接種量、溫度對菌株JX20產果膠酶活力的影響.

(1)發酵時間 初始發酵時間調整初始為12、24、36、48、60、72、84、96、108 h，其它發酵條件為初始發酵條件.分析發酵時間對菌株JX20產果膠酶活力的影響.

(2) 碳源及其濃度 發酵時間為60 h，考察碳源分別為葡萄糖、淀粉、麥芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、玉米粉、麥麩，其它發酵條件為初始發酵條件.分析碳源及其濃度對菌株JX20產果膠酶活力的影響.

(3) 氮源及其濃度 發酵時間為60 h、碳源源取上述實驗確定的最優結果，考察氮源分別為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆粕、(NH4)2SO4、NH4NO3、檸檬酸銨，其它發酵條件為初始發酵條件.分析氮源及其濃度對菌株JX20產果膠酶活力的影響.

(4) 初始pH 發酵時間為60 h、氮源、氮源取上述實驗確定的最優結果，考察初始pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，其它發酵條件為初始培養條件.分析初始pH對菌株JX20產果膠酶活力的影響.

(5) 接種量 培養時間60 h、氮源、氮源、初始pH取上述實驗確定的最適結果，考察接種量分別為0.5%、1%、2%、4%、6%、8%、10%(v/v)，其它發酵條件為初始發酵條件.分析接種量對菌株JX20產果膠酶活力的影響.

(6) 發酵溫度 發酵時間為60 h、氮源、氮源、初始pH與接種量取上述實驗確定的最適結果，考察發酵溫度分別為25、28、31、34、37、40 ℃.分析發酵溫度對菌株JX20產果膠酶活力的影響.以上試驗每組3個平行，用軟件Excel 2016繪制出發酵產酶條件優化的各個因素圖.

(7)響應面法優化 根據上述單因素試驗的結果，確定響應面法優化的最優區間.用Design-Expert軟件設計4因素3水平響應面實驗，探究發酵溫度、麥芽糖濃度、酵母膏濃度以及初始pH等影響因素對果膠酶活力的影響，從而優化發酵條件.

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

2.1.1 初篩 通過選擇性培養基分離篩選到21株能產生果膠酶的菌株，加入盧戈氏碘液后，菌落周圍出現了明顯的透明圈，分別用游標卡尺測量菌落(d)與透明圈(D)的直徑，并計算其比值.其比值大于2.0有菌株JX02、JX07、JX08、JX12、JX17、JX20，故選取這6個菌株進行液體搖瓶發酵，然后測酶活進行復篩.

2.1.2 復篩 將透明圈直徑與菌落直徑比值大于2.0的6個菌株JX02、JX07、JX08、JX12、JX17、JX20接種于液體產酶培養基進行搖瓶培養，72 h后，測定其發酵粗酶液的果膠酶活力.其中編號為JX20的菌株酶活為124.87 U·mL-1，相對于其它5種菌株來說，酶活力最高，故最終選取菌株JX20進行后續試驗.

2.1.3 菌株的鑒定 將菌株JX20點接于PDA培養基上，觀察其形態變化.結果發現該菌株生長速度較快，菌落正面初期為白色，培養時間稍長后，孢子變為黃綠色，且黃綠色部分越來越多.該菌落呈絲絨狀，中央有白色凸起，有放射狀溝紋.與培養基結合較牢固，不易挑取.菌落不透明，無滲出液，背面略帶黃色.在插片法所得的蓋玻片上滴加棉藍染色液后，于鏡下觀察，菌絲有分隔，分枝較多，分生孢子梗由一根直立的菌絲形成，分生孢子為球形，分生孢子頭呈放射狀，頂囊近球形，產生數條放射狀的分生孢子鏈.為此，初步鑒定其為曲霉屬菌株.

PCR擴增產物進行測序，其有效長度為594bp.將測定得到的ITS-rDNA序列與GenBank數據庫中的已知序列進行同源性比對和分析，尋找與目的基因序列同源性較高的分類地位的菌株，然后從數據庫中選取相關種屬菌株的的ITS-rDNA序列，采用N-J法構建系統發育進化樹，結果如圖1所示.從系統發育樹看出菌株JX20與與曲霉屬菌株的ITS序列同源性最高，且與黃曲霉(AspergillusflavusAG20 KG482648)聚于同一個分支上，且親緣關系最近，同源性達到99%以上.結合菌株JX20菌落和菌絲形態特征，確定菌株JX20為黃曲霉(AspergillusflavusJX20).

圖1 菌株JX20基于ITS-rDNA序列進化樹Fig.1 The phylogenetic tree of strain JX20 based on ITS-rDNA sequence圖2 培養時間對產酶活性的影響 Fig.2 Effect of culture time on enzyme activity

2.2 發酵產酶條件優化

圖3 碳源對產酶活性的影響Fig.3 Effect of carbon source on enzyme activity

2.2.1 發酵時間對菌株JX20果膠酶活性的影響 根據1.3.6(1)方法，分析發酵時間對產酶活性的影響，其結果如圖2所示.該菌株在12～24 h酶活力變化不大，隨著時間的延長酶活力持續升高，并于72 h達到峰值，為126.68 U/mL，之后酶活力開始緩慢下降.菌株JX20在培養初期，液體培養基內的營養物質主要用于菌體的生長需要，發酵產物積累較少.當酶活性達到峰值后，隨著發酵時間的持續延長，酶活性開始略微降低，可能是由于營養物質的耗盡以及代謝產物的大量積累，導致菌體自溶[8].因此，選取72 h作為發酵產酶時間.

2.2.2 碳源及其濃度對菌株JX20產果膠酶的影響 根據1.3.6(2)方法，在培養基中分別加入1.0 %不同的碳源，分析碳源對產酶活性的影響，其結果見圖3.當選擇麥芽糖作碳源時，產果膠酶活力最高達到140.23 U/mL，而玉米粉、麥麩和葡萄糖作為碳源時，酶活力呈現下降趨勢.當淀粉和蔗糖作為碳源時，酶活性降低比較明顯.因此，菌株JX20培養的最適碳源為麥芽糖.

為考察麥芽糖不同濃度對產酶活性的影響，其結果如圖4所示.隨著麥芽糖濃度的增加，該菌的果膠酶活性逐漸升高，當其濃度為10 g/L時，其活性達到最高值，為140.23 U/mL；當麥芽糖濃度高于1.0 %時，其酶活性有所降低.取0.5%～1.5%的濃度范圍進行優化發酵條件.

2.2.3 氮源及其濃度對菌株JX20產果膠酶的影響 根據1.3.6(3)方法，在發酵培養基中分別加入1.0 %的不同氮源，分析氮源對菌株JX20產果膠酶的影響，其結果見圖5.微生物的生長代謝離不開氮源，氮源是組成蛋白質和核酸的重要物質.當氮源為無機氮(NH4)2SO4和NH4NO3時，果膠酶活性均較低，且低于108.59 U/mL；而氮源為有機氮時，菌株JX20發酵液的果膠酶活性相對于無機氮來說均有明顯增高，當酵母膏作為氮源時，果膠酶活性達到峰值，為151.41U/mL.因此，菌株JX20的最適培養氮源為酵母膏.

圖4 麥芽糖濃度對產酶活性的影響Fig.4Effect of maltose concentration on enzyme activity圖5 氮源對產酶活性的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on enzyme activity

為確定酵母膏不同濃度對發酵產酶活性的影響，其結果見圖6.隨著酵母膏濃度的增加，菌株JX20產果膠酶活性逐漸升高，當其濃度為20 g/L時，其酶活性達到峰值，為162.53U/mL；當酵母膏濃度高于2.0 %時，其酶活性有所降低.因此，酵母膏濃度為15 ～20 g/L 是優化的最佳范圍.

2.2.4 培養基初始pH對菌株JX20產果膠酶活力的影響 根據1.3.6(4)方法，分析不同初始pH值對產果膠酶活性的影響，結果如圖7所示.菌株JX20隨著pH值的增大所產果膠酶活性逐漸增加，當pH值為5.0時酶活性達到峰值，為172.37 U/mL.而隨著pH值的進一步增大，果膠酶的酶活反而下降明顯，說明菌株JX20在弱酸性的條件下，比較適合產酶，pH值過高或過低對產酶都會產生很大的抑制作用.因此，優化發酵條件的最適pH值為4.5～5.5.

圖6 酵母膏濃度對產酶活性的影響Fig.6 Effect of yeast extract concentration on enzyme activity圖7 初始pH對產酶酶活性的影響Fig.7 Effect of initial pH on enzyme activity

2.2.5 接種量對菌株JX20果膠酶活力的影響 根據1.3.6(5)方法，分析不同接種量對產果膠酶活性的影響，結果如圖8所示.當接種量在0.05-2.0%(v/v)時，隨著接種量的增加，菌株JX20所產果膠酶的酶活明顯升高；當接種量2.0%(v/v)時，其酶活性達到峰值，為180.33 U/mL.此后，隨著接種量的增大酶活性略微下降，可能是由于接種量的增大導致發酵液中菌體濃度迅速過高，導致菌體生長過度旺盛，營養物質消耗過快，而溶氧卻不足，導致代謝受抑制，最終產酶能力降低.因此，菌株JX20的最適接種量為2.0%.

2.2.6 發酵溫度對菌株JX20果膠酶活力的影響 根據1.3.6(6)方法，分析發酵溫度對菌株JX20產果膠酶活性的影響，結果由圖9所示.當溫度在20～31℃時，隨著溫度的升高，菌株JX20所產果膠酶的活性逐漸升高；當溫度為31℃時，其酶活達到峰值，為202.66 U/mL，而當溫度進一步升高時，酶活性反而下降比較明顯，可能是因為溫度過高，不利于菌株JX20代謝產酶.因此，優化發酵條件的最適發酵溫度范圍為28℃～34℃.

圖8 接種量對產酶活性的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on enzyme production activity圖9 培養溫度對產酶活性的影響Fig.9 Effect of culture temperature on enzyme production

2.2.7 響應面試驗設計及最優條件的確定 根據上述果膠酶發酵試驗的結果，用Design-Expert軟件設計4因素3水平的響應面實驗，以果膠酶酶活力大小作為考察指標，響應面試驗設計的因素水平與試驗結果如表1和表2所示.

利用軟件對試驗數據進行分析得到以酶活性為響應值的回歸線方程(表3)為：Y=237.87+9.21A+5.82B-1.94C+1.81D+1.53AB+2.82AC-0.75AD+0.21BC+0.070BD-0.26CD-42.00A2-3.80B2-2.94C2-8.09D2(R2=0.987 0，P<0.000 1).

由表3可知，回歸方程的R2=0.987 0，近似為1，表明其擬合度較好.而CV=1.70%表明試驗的重復性較高.而回歸方程的P<0.000 1，說明對結果差異極顯著；而失擬項的P>0.05，說明失擬項不顯著.發酵條件的四個因素對酶活性的影響大小為A>B>C>D；一次項A、B，二次項A2、B2、D2都極顯著，其他因素都不顯著.利用Design-Expert軟件繪制溫度、麥芽糖濃度、酵母膏濃度以及初始pH四個因素之間的交互作用對酶活性影響的響應面如圖10.

圖10 兩因素交互作用對果膠酶活力的影響Fig.10 Interaction effects of two factors on pectinase activity

根據響應面坡度的陡峭程度、等高線的密集程度及其成橢圓形的程度表示兩因素交互作用影響大小的原則，由圖10可知，溫度與麥芽糖濃度之間所形成的交互作用最強，而初始pH與麥芽糖濃度所形成的交互作用最弱.結合方差分析可知各因素交互作用大小為AB>AC>AD>BC>CD>BD.

最后綜合響應面結果分析出的果膠酶活力最優條件為麥芽糖0.95 %，酵母膏1.87 %，初始pH 5.06，培養溫度為31.34℃.在此條件下進行3次重復性實驗，其果膠酶酶活力為245.38 U/mL.結果與預測值基本符合，表示該模型與實際情況基本吻合，擬合良好.

3 結論與討論

本研究從橘子、香蕉、蘋果、柚子的果肉及果皮的腐爛部分等多份樣品中篩選出一株高產果膠酶的菌株，利用無機鹽培養基等作為搖瓶培養基材料，對菌株進行培養發酵，結合單因素法與響應面法對發酵條件進行優化從而得到酶活最適的條件.研究表明：發酵優化條件為麥芽糖0.95 %，酵母膏1.87 %，接種量2.0%，初始pH 5.06，發酵周期為72 h，培養溫度為31.34 ℃，在此條件下，該菌的果膠酶活力達到245.38 U/mL；發酵條件對酶活力影響的大小順序為：培養溫度>麥芽糖濃度>酵母膏濃度>初始pH；以果膠酶活力為目標函數的模型為：Y=237.87+9.21A+5.82B-1.94C+1.81D+1.53AB+2.82AC-0.75AD+0.21BC+0.070BD-0.26CD-42.00A2-3.80B2-2.94C2-8.09D2(R2=0.987，P<0.000 1).最后對其進行形態學鑒定，并結合ITS-rDNA測序結果，確定該菌株為黃曲霉菌(Aspergillussp.).

本試驗采用果膠酶盧戈氏碘液透明圈法分離果膠酶產生菌，獲得果膠酶活力較高的野生菌株JX20.試驗研究發現菌株JX20果膠酶的適宜pH是偏酸性，在pH5.0時其酶活性最高，當pH4.5～6.0時，仍具有較高的酶活性，所以在果皮發酵分解過程中，菌株JX20仍然具有較高果膠酶活性，這將為在酸性條件下降解果皮提供了可能.菌株JX20果膠酶屬酸性，多用于水果榨汁和果汁澄清，且目前固體發酵的果膠酶酶活明顯高于液體發酵產果膠酶的酶活[12].我國果膠酶生產工業領域以固體發酵生產為主，雖然產酶的酶活較高，但其雜蛋白較多分離純化成本高，且產品的質量與產量達不到要求，因此需更進一步對液體發酵的研究[13].雖然通過發酵條件優化處理，使得果膠酶活力有所提高，但野生菌株的產酶活力相對活性較低，可將該菌株JX20通過誘變選育或者基因工程改良獲得產果膠酶活性更高的優良菌株.