不同活性干酵母對椴樹蜜酒發酵的影響

薛 松，劉彩云，于 帆，林 劍

（1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺 264000；2.煙臺華海生物制品有限公司，山東煙臺 264000）

蜂蜜中含有糖類、蛋白質、礦物質及多酚類化合物等，所含物質總數超出200 多種[1]，并且具有抑菌消炎、抗衰老、增強免疫力等多種生物活性功能，被認為是自然界中的天然保健品[2]。椴樹蜜擁有椴樹花濃郁清新的香味[3]，清新香甜，是東北特有的蜜種之一，其營養成分的含量高于普通蜂蜜。椴樹蜜中的高營養成分決定了其是一種天然的滋補品，但是由于其富含高含量的糖類物質而使其飲用人群大大受限[4]，因此，將其制成一種適合多數人飲用的發酵飲料具有重要的應用價值。

蜜酒具有十分悠久的歷史，曾經被稱之為世界上最古老的酒精飲料，其出現的時間比之葡萄酒和啤酒都早約幾千年[5]。椴樹蜜酒是以椴樹蜜為原料，經過發酵、過濾、陳釀后制成，研究表明，經發酵釀制而成的蜜酒，除了蜂蜜本身所含的絕大部分葡萄糖和果糖轉化為乙醇外，蜂蜜原有的氨基酸、維生素、礦物質、多酚類化合物和超氧岐化酶等成分得到保留[6]，因此，椴樹蜜酒既包含椴樹蜜原本的營養成分，又有發酵酒的醇香，是一種口感柔和的低度保健飲料酒[7]。

傳統的蜜酒釀造過程存在較多的問題，例如：發酵時間的延遲、發酵過程中不良風味的產生進而導致蜜酒產品的感官品質降低。因此，以科學的手段提高蜜酒的品質是目前研究的關鍵所在[8]。酵母菌是蜜酒釀造過程中最為關鍵的所在，不同酵母在發酵過程中，由于代謝產物種類和含量的差異，發酵所得產品的質量和類型也有所不同[9]，因此研究人員在釀制蜜酒的過程中通常會對酵母進行選擇，如史瑩[10]從烏桕蜂蜜中篩選出1 株釀酒酵母，相比較對照組的酵母更耐酒精，而且發酵所得的蜜酒口感更出色。因此，優選出最適的椴樹蜜酒酵母是椴樹蜜酒發酵產業的關鍵問題。

長期以來，國內外的科研人員大多采用單一的方法對發酵酒進行評價，馮紅艷等[11]采用氣相色譜法測定啤酒中的風味物質，為啤酒生產確定最佳工藝參數；黃琳等[12]單一以感官評分為評價指標，研究了不同發酵條件對啤酒感官品質的影響。以單一因素對蜜酒產品進行評判，因多方面的原因會導致實驗結果不夠準確，進而誤導對產品的最終評判。本研究以椴樹蜜酒感官得分同時聯合氣相色譜技術，通過模糊綜合評判法對蜜酒進行綜合評價，進而優選酵母，為椴樹蜜酒發酵過程中活性干酵母的優選提供更加準確、科學、可信的評判結果。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 酵母菌株

選用葡萄酒釀造過程中廣泛使用的活性干酵母，分別編號為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8，由煙臺帝伯仕自釀機有限公司提供。

1.1.2 椴樹蜜

中蜂國際生物科技有限公司提供。

1.1.3 儀器設備

高效液相色譜儀（Waters 1525），美國Waters 公司；氣相色譜儀（Agilent 7890A），美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 椴樹蜜酒精發酵工藝流程

椴樹蜜→調整可酵解糖濃度和pH 值→滅菌→接種→發酵→過濾、除菌→椴樹蜜酒樣

操作條件：調整培養基中可酵糖含量為160 g/L，添加2 ‰的酵母浸出物作為外加氮源，磷酸調整pH5.5，120 ℃滅菌20 min，冷卻后待用。將活性干酵母在25 ℃條件下靜置復水活化30 min[13]，按照2 %的接種量接種到培養基中。25 ℃條件下進行發酵[14]，每隔24 h取樣1次，對樣品離心、抽濾，采用高效液相色譜法測定樣品中的還原糖和酒精含量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 發酵液中還原糖的測定——高效液相色譜法

色譜條件[15]：流動相0.01 mol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫50 ℃。

1.2.2.2 發酵液中酒精的測定——高效液相色譜法

色譜條件：流動相0.01 mol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL，柱溫50 ℃，示差折光檢測器溫度50 ℃。

1.2.2.3 發酵液中揮發性風味物質的測定——氣相色譜法

色譜條件[16]：檢測器溫度280 ℃，進樣溫度100 ℃，進樣時間1 min，樣品瓶壓力1.39×105 Pa，載氣為N2（99.999 %），流速為4 mL/min，H2流速30 mL/min，空氣流速400 mL/min。

1.3 椴樹蜜發酵所得酒樣的感官評價

感官評價組由2 名發酵專業老師及12 名相關專業學生組成，按照表1 評分標準對8 株不同活性干酵母發酵所得酒樣進行評分。

1.4 活性釀酒干酵母的優選

通過比較8 株不同活性釀酒干酵母的發酵性能，綜合椴樹蜜酒精樣品的感官得分及其所含揮發性風味物質的含量，利用模糊綜合評判法優選出最佳椴樹蜜酒釀造活性干酵母。

2 結果與討論

2.1 不同酵母發酵性能的比較

參照方法1.2.2.1 和1.2.2.2，對8 種不同菌株發酵能力的測定結果見圖1、圖2。

由圖1 和圖2 可以看出，F1 和F5 菌株無論是在底物還原糖的消耗還是產物乙醇的生成速度方面都是較慢的，說明其發酵能力相對較弱；F4 菌株較剩下其余菌株的發酵能力較強；菌株在前6 天發酵速度相對較快，在第6 天以后，由于底物濃度的減小以及產物濃度的增大，產生阻遏作用，菌株的發酵速度減慢，相對平緩，在第9天時，發酵結束。

表1 感官評分細則表

2.2 不同菌株發酵椴樹蜜酒中香氣成分含量的測定及感官評分

參照方法1.2.2.3和1.3，對8株不同酵母菌株發酵所得蜂蜜酒中香氣成分含量的感官得分及測定結果見表2和表3。

表2 不同椴樹蜜酒樣的感官得分

高級醇和酯類是酵母正常發酵的代謝產物，也是組成酒類風味的重要成分[17]，是酒類香氣的主要載體，賦予酒類醇厚感。實驗共選取7 種對蜂蜜酒風味影響較大的物質進行分析，結合表2 感官評分發現，感官評分得分較高的酵母菌株，相對應蜂蜜酒香氣成分中高級醇和酯類物質的含量也略高于其他菌株。

表3 不同椴樹蜜酒樣中主要香氣成分的定量分析結果

2.3 模糊綜合評判法優選最佳活性干酵母

2.3.1 建立評判對象集

2.3.2 建立評判因素集

根據已有文獻報道[18]，確定高級醇和酯類為椴樹蜜酒中的主要揮發性成分，同時結合表2 的感官評分，建立評判因素集為X={x1，x2……，xn}={x1，x2，x3}，其中x1—感官評分，x2—高級醇類，x3—酯類。

2.3.3 建立隸屬函數模型

根據表2 構造感官評分因素的隸屬函數（感官評分低于70分的樣品不參與評價）：

U（x1）=x1/100，70≤x1＜100

椴樹蜜酒香氣成分的含量在一定范圍內與椴樹蜜酒的品質呈正相關，所以可以構造高級醇和酯類的線性上升隸屬函數[19]，結合表3 構造隸屬函數如下：

2.3.4 建立權重集

研究表明，高級醇和酯類對酒類產品的香氣影響較大，且酯類的影響更加明顯，結合感官評價，根據德爾菲法（Delphi technique）[20]確定權重分配為A={a1，a2……，an}={a1，a2，a3}={0.35，0.3，0.35}，其中

2.3.5 模糊綜合評判計算

對Ui的每個因子利用U（xi）進行模糊化，可得到x×y上的模糊矩陣R：

利用模糊線性變換法得到的評判結果為：

B=A × R=[0.623 0.649 0.727 0.794 0.559 0.899 0.613 0.841]，

其中，模糊算子為M（·，⊕），即，（j=1，2，k，n），歸一化處理得：

B=[0.109 0.113 0.127 0.139 0.097 0.157 0.107 0.147]

模糊綜合評判的結果椴樹蜂蜜酒品質方面體現出不同釀酒酵母的優劣，結合上述8 株不同活性干酵母發酵性能測試結果可以得出各酵母菌株的優劣：F6＞F8＞F4＞F3＞F2＞F1＞F7＞F5。可以看出F6 酵母為最佳椴樹蜜酒發酵酵母，F8 和F4 次之，F5酵母菌株發酵性能最差。

3 結論

本研究測定了發酵過程中8 株不同釀酒活性干酵母菌株對底物的消耗速率及產物的生成速率，以所得不同酵母菌株的發酵性能作為參照，結合不同酵母菌株發酵所得椴樹蜜酒樣感官評價得分以及其所含揮發性風味物質含量的測定，利用模糊綜合評判的方法優選出F6 酵母為最佳椴樹蜜酒釀酒活性干酵母，后續仍需對優選出的酵母菌株做深入的發酵過程動態研究。本方法對于其他酒類飲品所用最佳釀酒酵母的優選也具有一定的參考意義，為酵母的優選提供了一種更科學、可信的途徑。