黃花菜花粉生活力鑒定和萌發率測定方法研究*

張 琨 殷麗麗 韓志平 陳枝文 王一衡

（1.山西大同大學生命科學學院，山西大同大學設施農業技術研發中心，山西 大同 037009；2.天津市農業科學院生物技術研究所，天津 西青 300384）

黃花菜（Hemerocallis citrinaBaroni）屬百合科萱草屬，為我國一種藥食同源的特色蔬菜[1]。我國是世界上黃花菜種質資源最豐富的國家，現有黃花菜品種60余種[2]。由于黃花菜不同品種間的形態差別不大，加之長期進行無性繁殖，缺乏新的優良基因的融合，使品種間的遺傳差異不斷縮小，品種退化日益凸顯。

雜交是作物育種的主要手段，雖操作簡單，但結實率較低，很難獲得成功。花粉生活力強弱是決定雜交成功與否的關鍵。明確黃花菜花粉生活力的測定方法及測定標準，對選育雜交新品種非常重要。近幾年對黃花菜的研究主要集中在栽培管理技術、組織培養快繁、加工保鮮工藝及功能成分分析等方面[3～6]，對其花粉生活力的研究不夠系統。目前花粉生活力測定方法主要有兩種，即染色法和花粉離體萌發法。染色法因方便快捷、操作簡單，被廣泛應用于不同植物的花粉檢測；花粉離體萌發法檢測花粉生活力最準確，花粉離體萌發能力是判斷花粉生活力最有效的指標[7]。大量研究表明，培養基中蔗糖、硼酸等主要成分對花粉萌發及花粉管伸長具有不可替代的重要作用[8]。蔗糖是供給花粉離體萌發最重要的能量物質，其濃度決定了花粉離體萌發的成敗。本研究以黃花菜為材料，比較不同染色法的染色效果和不同蔗糖濃度對黃花菜花粉離體萌發的影響，以期篩選出快速而準確的黃花菜花粉生活力測定方法，為黃花菜人工授粉及品種改良提供最佳的工作方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黃花菜品種為大同花。大同花黃花菜于2015年引種于山西大同大學生命科學學院實驗基地，田間管理措施按常規。2019 年9 月植株盛花期開始，每天于晴天上午8～10 時從生長良好、無病蟲害的黃花菜植株上采摘即將開放的花蕾帶回實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉染色劑篩選

取現采的花蕾，將花藥連同花絲拔下，用鑷子抖動離花藥較近的花絲，使花粉落至載玻片的中央，分別使用1%醋酸洋紅、1%亞甲基藍和0.5%氯化三苯基四氮唑（TTC）對黃花菜花粉常溫染色15 min。記錄不同處理的染色結果，篩選出適宜的花粉染色劑。每個處理3次重復，每個重復進行3個視野的觀察。

1.2.2 染色時間研究

取現采的花蕾，將花粉抖落至載玻片的中央，滴加1～2 滴篩選出的染液。設置6 個染色時間，分別為10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min。常溫培養完成染色后，用顯微鏡觀察各染色時間處理花粉的染色結果，計算染色率[9]，篩選出最佳的花粉染色時間。每個處理3次重復，每個重復進行3個視野的觀察。

1.2.3 不同蔗糖濃度下黃花菜花粉萌發率測定

采用液體培養法，在300 mg/L硼酸加50 mg/L氯化鈣的基本培養基上[10～11]設置6個蔗糖濃度梯度，分別為0 g/L、30 g/L、60 g/L、90 g/L、120 g/L、150 g/L。將花粉抖落在載玻片的中央，滴加2 滴配制好的培養基，將載玻片放入鋪有濕潤濾紙的培養皿中常溫培養6 h，然后制成壓片進行顯微觀察。每個處理3 次重復，每個重復進行3個視野的觀察。花粉萌發以花粉管長度超出花粉粒直徑為判斷依據[12]，計算萌發率。

1.3 數據分析

利用SPSS 24.0軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同染色劑對黃花菜花粉活力測定結果的影響

黃花菜花粉染色顯微觀察結果如圖1所示。醋酸洋紅染色下，花粉粒均被染為鮮紅色，在顯微鏡下差異極小，無法判斷花粉活性（圖1a）；用TTC 染液染色的花粉，花粉粒均被染為暗紅色，在顯微鏡下差異也不明顯（圖1b）；當使用亞甲基藍染色時，在顯微鏡下觀察到有活力的花粉被染成了藍色，而喪失活力的花粉則沒有著色，顯微鏡下差異顯著，效果明顯（圖1c）。由此可見，醋酸洋紅染液和TTC 染液不宜用于測定黃花菜花粉生活力，亞甲基藍較適宜用于測定黃花菜花粉生活力。

圖1 不同染色劑對黃花菜花粉生活力測定的結果

2.2 不同染色時間對黃花菜花粉生活力測定結果的影響

根據染色劑的篩選試驗結果，對亞甲基藍的染色時間作進一步研究試驗，試驗結果如圖2 所示。染色時間為10～25 min 時，黃花菜花粉染色率隨亞甲基藍染色時間的延長而增加，花粉的平均染色率分別達到34.37%、37.70%、48.64%和52.47%；染色10 min 和15 min 處理，花粉染色率差異不顯著，20 min 染色處理花粉平均染色率顯著高于10 min 和15 min 染色處理，但較25 min 染色處理差異不顯著；染色時間繼續增加，達到30 min、35 min 時，染色率分別為49.81%和52.48%，較20 min 染色處理均無顯著差異。由此可見，測定黃花菜花粉生活力的染色時間以20 min為佳。

圖2 染色時間對黃花菜花粉染色率的影響

2.3 蔗糖濃度對黃花菜花粉萌發的影響

蔗糖濃度對黃花菜花粉萌發的影響見表1。

表1 各處理黃花菜花粉的萌發率

由表1 可知，黃花菜花粉萌發率隨培養基中蔗糖濃度的增加呈先升高后降低趨勢。培養基中不含蔗糖時，黃花菜花粉萌發率最低，僅為4.22%，且花粉管伸長不明顯（見圖3a）；當蔗糖濃度增至30 g/L 時，黃花菜花粉萌發率達到最大值，為59.18%，萌發花粉的花粉管長度也最長（見圖3b）；蔗糖濃度繼續增加至60 g/L時，黃花菜花粉萌發率略有下降，為52.33%，較30 g/L 處理差異不顯著，花粉管長度也較長，僅次于30 g/L 處理（見圖3c）；當蔗糖濃度升至90 g/L時，黃花菜花粉萌發率迅速降低，僅為14.31%，較30 g/L處理和60 g/L處理差異達極顯著，花粉管長度下降（見圖3 d）；當蔗糖濃度為120 g/L 和150 g/L 時，花粉萌發率繼續下降，分別為6.28%和5.48%，較不加蔗糖處理差異不顯著，但均顯著低于90 g/L 處理，花粉管形態粗短（見圖3e、圖3f）。由此可見，黃花菜花粉離體萌發最適蔗糖濃度為30 g/L。

圖3 不同蔗糖濃度對黃花菜花粉管生長的影響

3 結論與討論

準確鑒定花粉活力是植物雜交育種的基礎條件。通過對花粉進行染色制片，即可利用顯微鏡觀察快速檢測花粉活力。目前，用于檢測花粉活力的染色方法有醋酸洋紅染色法、TTC染色法、亞甲基藍染色法和I2-KI 染色法等，但不同植物的鑒定方法常因物種差異而各不相同。研究表明，TTC 染色法是鑒定金娃娃萱草花粉生活力的最佳染色方法，染色時間為35～40 min時染色效果最佳[13]；I2-KI適用于四川牡丹花粉生活力的快速鑒定[14]；醋酸洋紅染色法適用于油菜花粉生活力的測定[15]；次亞甲基藍和α-萘酚-聯苯胺適用于快速檢測貼梗海棠花粉的生活力[16]。本研究采用3 種不同染色法對黃花菜花粉生活力進行了檢測，發現用醋酸洋紅和TTC 染液染色的花粉顏色差異極小，而在亞甲基藍作用下，有生活力的花粉被染成了藍色，與無生活力花粉顏色相比差異顯著。因此，亞甲基藍染色法可作為一種經濟、便捷、安全的方法用于黃花菜花粉生活力的快速檢測。除染色劑外，染色時間對染色效果也有一定的影響。染色時間太短，染色劑與花粉中的相關物質或酶反應不充分，染色率低；染色時間過長，又可能降低參與染色反應的酶活性，影響檢測準確性，同時也不利于染色法的快速檢測，影響檢測效率。本試驗在明確亞甲基藍染色法為黃花菜花粉生活力檢測最適宜方法的基礎上，對亞甲基藍的染色時間做了進一步研究，結果發現染色20 min 時黃花菜花粉平均染色率較高，之后隨著染色時間的增加，平均染色率有所提高，但較染色20 min 差異并不顯著。綜上所述，利用亞甲基藍染色20 min，即可對黃花菜花粉生活力實現快速測定。

選用染色法鑒定花粉生活力，雖然經濟便捷，容易掌握，但因染色法是通過花粉中營養物質含量或代謝情況反映花粉生活力，衰老或死亡的花粉也可能會著色，且染色后有活性與無活性染色界線不易分辨，會造成測定值偏高，不能準確反映花粉的生活力[17～18]。離體萌發法雖然需要較長時間培養，但可實現對花粉生活力的完全定量檢測[18]。蔗糖是花粉離體培養最重要的能量物質，其不僅能維持外界環境的滲透平衡[19]，還可在一定程度上減少微生物的污染（大部分微生物生長所需碳源為葡萄糖）。適宜濃度的蔗糖可在一定程度上緩解花粉破裂，促進花粉萌發和花粉管生長。蔗糖濃度過低易使花粉吸水漲破，導致花粉內容物流出，而濃度過高又會造成花粉脫水，導致其活性降低，對花粉萌發產生明顯的抑制作用[20～21]。本試驗結果印證了上述結論，較低或較高濃度的蔗糖均不利于黃花菜花粉萌發，黃花菜花粉離體萌發適宜的蔗糖濃度為30 g/L。

為提高檢測的準確性，可將亞甲基藍染色法與花粉離體萌發法結合起來，即先利用染色法判斷黃花菜花粉生活力的基本情況，再通過離體萌發法實現花粉生活力的定量檢測。在后續研究中，為進一步提高黃花菜花粉的萌發率，還需對培養過程中硼酸、溫度等條件進行研究，同時應擴大選材范圍，分析和掌握不同品種黃花菜花粉生活力的差異，為開展黃花菜雜交育種工作提供更好的方法。