miR-19-3p靶向TC-1對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

尹雪蓮 楊光 馬東杰 蘇哲君 霍峰 王鵬

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科，河北 承德 067000；2秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院手術室)

口腔鱗癌是一種非常常見的口腔頜面部的惡性腫瘤之一，威脅人類的生命健康安全〔1〕。miRNA為長度在18～25個核苷酸之間的內源性短鏈非編碼RNA，其在癌癥發(fā)生發(fā)展中的調控作用受到關注〔2，3〕。miR-19-3p在多種癌癥表達失調，但其在口腔鱗癌中的作用機制仍需繼續(xù)探索。甲狀腺癌相關基因(TC)-1位于8p11～12，是一種含106個氨基酸編碼的固有無序蛋白，廣泛表達多種組織器官中，其在許多信號通路中均起重要作用，例如Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路，且參與許多癌癥的發(fā)展〔4，5〕。但miR-19-3p在口腔鱗癌中與TC-1的相互作用關系尚未清楚。本研究旨在探討miR-19-3p對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和凋亡的調控機制。

1 材料與方法

1.1材料 31例口腔鱗癌癌旁組織和39例口腔鱗癌組織均來自承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院2018年2～12月接受外科手術切除的病例。患者及家屬均簽署知情同意書。人口腔鱗癌細胞CAL27、Tca8113均購自美國菌種保藏中心；胎牛血清購自杭州四季青；DMEM培養(yǎng)基購自北京康為世紀；CCK-8試劑購自日本同仁；胰蛋白酶購自美國GIBCO公司；LipofectamineTM3000試劑購自Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自；qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；Transwell小室購自美國Corning公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自德國羅氏診斷有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京森貝伽公司；雙熒光素酶報告實驗試劑盒購自上海碧云天生物研究所。

1.2細胞培養(yǎng) 用RPMI1640完全培養(yǎng)基(10 %胎牛血清+1%雙抗)培養(yǎng)人口腔鱗癌細胞CAL27、Tca8113，在37℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。

1.3細胞分組 將miR-19-3p mimics、miR-NC、pcDNA、pcDNA-TC-1、miR-19-3p+pcDNA、miR-19-3p+pcDNA-TC-1與3倍量的脂質體混合均勻，再與CAL27細胞共培養(yǎng)8 h，添加新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR檢測轉染效率。將其分別標記為miR-19-3p組、miR-NC組、pcDNA組、pcDNA-TC-1組、miR-19-3p+pcDNA組、miR-19-3p+pcDNA-TC-1組。用于后續(xù)的qRT-PCR、Western印跡實驗、CCK-8、Transwell實驗和流式細胞術實驗。

1.4qRT-PCR實驗 將需要檢測的細胞或充分研磨的組織勻漿用RNA抽提試劑盒提取RNA、反轉錄試劑盒合成cDNA、qRT-PCR試劑盒進行miR-19-3p、LRIGl檢測。用2-△△Ct計算miR-19-3p、LRIGl的表達。

1.5Western印跡實驗檢測細胞TC-1、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、Bax、Bcl-2、E-鈣黏蛋白(cadherin)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2表達 將待檢測細胞用裂解液在冰上裂解30 min，提取總蛋白，并進行定量、變性。蛋白電泳結束后用轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜，再用2.5%脫脂奶粉室溫封閉處理2 h。加入稀釋過的Ⅰ抗溶液(1∶500～2 000)，4℃孵育12～14 h。加稀釋過的Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記的二抗)，37℃ 孵育2 h。最后用ECL加發(fā)光液進行顯影曝光。

1.6CCK-8法檢測細胞增殖 將需要檢測的細胞調整至5×105個/ml，取100 μl至96孔板，加入CCK-8反應液，在490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)。

1.7Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡 將待檢測的細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，再用 500 μl 結合緩沖液懸浮，按照 Annexin V-/FITC試劑盒要求操作，加入染色液，最后上流式細胞儀檢測分析凋亡情況。總凋亡率(%)為早期凋亡率與晚期凋亡率之和。每個樣品重復3次，實驗重復2次。

1.8Transwell小室檢測細胞遷移侵襲 將待檢測細胞按106個/孔接種細胞6孔板，用不含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。再將細胞調至105個/ml，取100 μl平鋪在小室的上表面，600 μl含血清的培養(yǎng)基加入小室的下室，將小室在37℃反應12 h。取出小室，除去上室膜上的細胞，再用甲醇固定、結晶紫染色。然后再顯微鏡下觀察細胞數(shù)量并計數(shù)，取平均值。

1.9雙熒光素酶報告基因實驗檢測細胞熒光活性 根據(jù)mircode在線網(wǎng)站(http：//www.mircode.org/)預測到的miR-19-3p與TC-1之間的結合位點，化學合成野生型TC-1基因序列(TC-1-WT)和突變型TC-1序列(TC-1-MUT)，并將其克隆到熒光載體psiCHECK-2，建立熒光素酶報告基因質粒，提取質粒DNA。將其與miR-NC、miR-19-3p共轉染。按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術手冊要求操作。結果用海腎熒光素活性與螢火蟲熒光活性的比值表達細胞的熒光活性。

1.10統(tǒng)計學分析 采用PEMS2.2軟件進行統(tǒng)計分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1miR-19-3p在口腔鱗癌組織和癌旁組織中的表達 與癌旁組織(1.13±0.08)相比，口腔鱗癌組織中miR-19-3p表達(0.28±0.02)顯著降低(t=63.995,P=0.000)。

2.2miR-19-3p過表達對口腔鱗癌細胞CAL27、Tca8113增殖的影響 與miR-NC組相比，miR-19-3p組CAL27、Tca8113細胞中miR-19-3p表達上調，CyclinD1蛋白表達下調，P21蛋白表達升高，24、48、72 h細胞活性降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。選用miR-19-3p過表達作用效果較明顯的細胞CAL27做后續(xù)實驗。

表1 miR-19-3過表達對細胞CAL27、Tca8113增殖的影響

圖1 miR-19-3p過表達對增殖相關蛋白表達的影響

2.3miR-19-3p過表達對口腔鱗癌細胞CAL27凋亡的影響 與miR-NC組相比，miR-19-3p組CAL27細胞中miR-19-3p、Bax蛋白上調，Bcl-2蛋白下調，細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2，圖3，表2。

圖2 miR-19-3p過表達對口腔鱗癌細胞CAL27凋亡的影響

圖3 miR-19-3p過表達對Bax、Bcl-2表達的影響

表2 miR-19-3過表達對細胞CAL27凋亡的影響

2.4miR-19-3p過表達對CAL27遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-19-3p組CAL27細胞中E-cadherin蛋白表達顯著升高，MMP-2蛋白表達顯著降低，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見圖4，圖5，表3。

圖4 miR-19-3p過表達對細胞CAL27遷移、侵襲的影響(結晶紫染色，×200)

圖5 miR-19-3p過表達對E-cadherin、MMP-2表達的影響

表3 miR-19-3p過表達對細胞CAL27遷移、侵襲的影響

2.5miR-19-3p靶向調控TC-1 miRcode在線預測網(wǎng)站顯示，miR-19-3p與TC-1之間存在互補的核苷酸序列(圖6)。與miR-NC組(1.12±0.08、1.08±0.09)相比，miR-19-3p組WT-TC-1細胞的熒光活性(0.35±0.02)明顯下調(t=22.872，P=0.000)，MUT-TC-1(1.02±0.07)差異無統(tǒng)計學意義(t=1.289，P=0.226)；與miR-NC組相比，miR-19-3p組細胞TC-1 mRNA和蛋白均顯著下調，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-19-3p組細胞TC-1 mRNA和蛋白均顯著上調(P<0.05)。見表4。

圖6 miR-19-3p靶向、調控TC-1

表4 miR-19-3p調控TC-1 mRNA、蛋白的表達

2.6過表達TC-1表達能逆轉miR-19-3p過表達對口腔鱗癌細胞CAL27增殖、凋亡、遷移、侵襲的作用 與miR-NC組相比，miR-19-3p組CAL27細胞中TC-1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達均顯著降低，Bax、E-cadherin蛋白表達均顯著升高，24、48、72 h細胞活性均顯著下降，細胞凋亡率顯著上升，細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著下降(均P<0.05)；與miR-19-3p +pcDNA3.1組相比，miR-19-3p +pcDNA3.1-TC-1組CAL27細胞TC-1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達均顯著上升，Bax、E-cadherin蛋白表達均顯著下降，24、48、72 h細胞活性均顯著上升，細胞凋亡率顯著下降，細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著上升(P<0.05)。見圖7、表5。

圖7 TC-1及凋亡、遷移蛋白的表達

表5 各組凋亡、侵襲蛋白表達及細胞活性、凋亡率、遷移、侵襲細胞數(shù)比較

3 討 論

miRNA是一類單鏈內源性非編碼小分子RNA，在腫瘤的發(fā)生、增殖和轉移過程中起至關重要的作用〔6〕。miR-17-92簇是第一個被鑒定的致癌miRNA，也稱為oncomir-1，其基因組擴增和高表達在各種類型的癌癥中均有發(fā)現(xiàn)，而miR-19是miR-17-92簇的關鍵成員，對促進腫瘤發(fā)生具有重要作用〔7～9〕。據(jù)報道，miR-19在乳腺癌、結直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、前列腺癌等很多癌癥中均出現(xiàn)異常表達〔10，11〕。Christopher等〔12〕在研究中通過生物信息學方法篩選口腔鱗癌中與炎癥相關的miRNA發(fā)現(xiàn)，miRNA-19a/b在調控口腔鱗癌的炎癥反應中具有顯著影響，推測miRNA-19a/b的靶基因對口腔鱗癌診斷和靶向治療有巨大潛力。本實驗發(fā)現(xiàn)，miR-19-3p在口腔鱗癌組織中表達明顯下調，這是國內外首次明確miR-19-3p在口腔鱗癌中的異常表達，為miR-19-3p在口腔鱗癌中的研究及開發(fā)奠定基礎；進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-19-3p抑制口腔鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進其凋亡，這些結果均在研究miR-19-3p對口腔鱗癌的診斷和治療中的潛在價值奠定基礎，也為后續(xù)進行miR-19-3p在其他癌癥中的功能及機制研究提供理論依據(jù)；深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-19-3p可靶向負調控TC-1的表達，這說明miR-19-3p對口腔鱗癌細胞表型的調控功能與調控TC-1有關，為miR-19-3p的調控機制研究提供依據(jù)。

TC-1是在2000年由澳大利亞學者Chua等〔13〕在研究甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)的一個新基因，后被命名為 C8orf4基因。近期，TC-1在肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胃癌中均出現(xiàn)表達異常升高〔14～17〕。白琳琳等〔18〕報道，TC-1在舌鱗癌組織中的過度表達與舌鱗癌的低分化程度相關。Zhang等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，TC-1在舌鱗癌組織中的表達明顯升高，且與晚期TNM分期顯著相關，其作用與調控Wnt /β-連環(huán)蛋白信號通路密切相關，提示TC-1的高表達水平可能通過增強Wnt信號通路的活性來促進OTSCC的進展。本研究結果顯示，TC-1表達可受miR-19-3p的抑制，且過表達TC-1也可逆轉miR-19-3p的表達，這暗示TC-1在口腔鱗癌細胞中的表達上調，為TC-1在口腔鱗癌中的功能研究奠定基礎；進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達TC-1還可逆轉miR-19-3p對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其相關蛋白表達的調控作用，這說明TC-1不僅可逆向調控miR-19-3p在口腔鱗癌細胞中的表達，還可逆轉miR-19-3p對口腔鱗癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，為miR-19-3p在口腔鱗癌中的功能及機制研究提供依據(jù)。

綜上，miR-19-3p在口腔鱗癌中低表達，過表達miR-19-3p可抑制口腔鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進凋亡，其機制與靶向TC-1相關，為口腔鱗癌的靶向治療提供新靶點。