紅芪多糖對糖尿病胃輕癱大鼠小腸組織c-kit、Cx43基因和蛋白表達的影響

魏昭暉，萬生芳，舒暢，王秋蘭，李榮科，張磊，王曉麗，何蘊良，馬欣欣，郭倩

論著·實驗研究

紅芪多糖對糖尿病胃輕癱大鼠小腸組織c-kit、Cx43基因和蛋白表達的影響

魏昭暉1，萬生芳1，舒暢1，王秋蘭1，李榮科1，張磊1，王曉麗2，何蘊良1，馬欣欣1，郭倩1

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.重慶市北碚區中醫院，重慶 400700

觀察紅芪多糖（HPS）對糖尿病胃輕癱（DGP）大鼠小腸組織酪氨酸激酶受體c-kit、縫隙連接蛋白Cx43基因和蛋白表達的影響，探討其對DGP大鼠腸動力障礙的作用機制。采用一次性大劑量腹腔注射鏈脲佐菌素聯合高糖高脂飼料不規則喂養方式復制DGP模型，將72只Wistar雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和HPS高、中、低劑量組，每組12只。陽性對照組予莫沙必利藥液0.7 g/（kg?d）灌胃，HPS高、中、低劑量組分別予HPS藥液0.2、0.1、0.05 g/（kg?d）灌胃，空白組和模型組分別予等體積純凈水灌胃，每日1次，連續8周。HE染色觀察小腸病理學結構改變；RT-PCR和Western blot分別檢測小腸組織c-kit、Cx43 mRNA和蛋白的表達。HE染色結果顯示，模型組大鼠小腸正常結構被破壞，大量炎性細胞浸潤；各給藥組大鼠情況改善，可見正常腸絨毛、中央乳糜管等結構，炎性細胞浸潤減少，其中以HPS高劑量組改善明顯。與空白組比較，模型組大鼠小腸組織c-kit、Cx43 mRNA和蛋白表達顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠小腸組織c-kit、Cx43 mRNA和蛋白表達顯著升高（＜0.05，＜0.01），HPS高劑量組作用最顯著。HPS通過上調c-kit、Cx43 mRNA和蛋白的表達提高小腸動力，改善DGP模型大鼠腸動力障礙。

糖尿病胃輕癱；紅芪多糖；c-kit；Cx43；大鼠

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是繼發于糖尿病基礎上以胃腸動力低下、胃排空延遲、胃節律紊亂為表現的一組臨床綜合征。DGP的發生發展多與高血糖、自主神經病變、平滑肌細胞受損等因素有關。近年來研究發現，胃腸動力性疾病多與Cajal間質細胞（interstitial cells of Cajal，ICCs）的缺失或缺陷等因素有關[1-4]。紅芪多糖（Hedysarum polybotrys polysacchcaide，HPS）為甘肅道地藥材紅芪的主要有效成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等功效[5]。本實驗觀察HPS對DGP大鼠小腸組織c-kit、Cx43 mRNA和蛋白表達的影響，進一步探討HPS對DGP的干預機制，為中藥治療DGP提供依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠72只，雄性，8周齡，體質量（180±20）g，甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（甘）2015-0002。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物房，溫度22～25 ℃，相對濕度5%～55%，自由攝食飲水。

1.2 藥物

HPS，西安天瑞生物科技有限公司，純度70%，批號TR20170508；枸櫞酸莫沙必利片，江蘇豪森藥業集團有限公司，批號H19990315。

1.3 主要試劑與儀器

血糖試紙（天津華鴻科技股份有限公司，批號07124112），鏈脲佐菌素（STZ，VETEC公司，批號WXBB0520V），Albumin Bovine V（北京索萊寶科技有限公司，批號913X054），Tris、Glycine、SDS、30%制膠液、Tris6.8、Tris8.8、PAGE膠促凝劑、20×TBST（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為929Y071、320P0610、ZJ0479、20181218、20180927、20190121、928I021、20180929），β-actin抗體（美國Abcam公司，批號GR3255609-1），c-kit（美國Abcam公司，批號GR3285391-1），Cx43（美國Abcam公司，批號GR3287932-1），無水甲醇（天津市富宇精細化工有限公司，批號20190628），無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司，批號20190616），Trizol（美國Ambion公司，批號182808），反轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒（日本Takara公司，批號分別為AI91403A、AI1246D-37520。D-37520型高速低溫離心機（江蘇金怡儀器科技有限公司），L600型低速離心機（北京時代北利離心機有限公司），TU-100型恒溫金屬浴（上海一恒科技有限公司），BIOMATE 3S型核酸蛋白測定儀，S1000TM型反轉錄儀，Chemi DOC XRS＋型凝膠成像分析系統，Varioskan LUX型酶標儀，PowerPacTMUniversal Power Supply型電泳及轉印電源（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 分組和造模

SPF級Wistar雄性大鼠72只，隨機分為空白組12只和造模組60只，適應性飼養1周。將STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5），配成1%溶液。大鼠禁食不禁水12 h，造模組大鼠稱重后按60 mg/kg一次性腹腔注射STZ，空白組大鼠腹腔一次性注射等體積0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液。72 h后尾靜脈采血，測定血糖＞16.7 mmol/L者為糖尿病大鼠。成模大鼠隨機分為模型組、陽性對照組和HPS高、中、低劑量組，以高糖高脂飼料不規則喂養（即單日上午進食，雙日下午進食），連續喂養6周，測定血糖，血糖大于16.7 mmol/L，并伴有腹部脹大、體質量減輕等表現，同時每組隨機抽取2只大鼠檢測離體腸平滑肌實驗，與空白組比較存在明顯小腸動力障礙等，確定為DGP大鼠。實驗期間，空白組大鼠給予普通飼料喂養，模型組和各給藥組大鼠給予高糖高脂飼料喂養。實驗過程中，模型組大鼠死亡4只，陽性對照組和HPS高、中、低劑量組各死亡2只。

2.2 給藥

陽性對照組按0.7 g/（kg?d）劑量給予莫沙必利灌胃。依據《中華人民共和國藥典》紅芪用藥量為9～30 g[6]，按每日平均給藥量15 g折算大鼠用量為原藥材1.5 g/（kg?d），紅芪多糖含糖率為70%，綜合考慮大鼠HPS給藥量為0.1 g/（kg?d），確定HPS高、中、低劑量組分別給予HPS 0.2、0.1、0.05 g/（kg?d）灌胃。莫沙必利及HPS分別溶于2 mL純凈水進行灌胃，空白組和模型組大鼠分別給予2 mL純凈水灌胃，每日1次，共8周。動物給藥量參照文獻[7-8]計算。

2.3 取材

第8周末，大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血4 mL，4 ℃離心，取上清液置于-80 ℃保存；小腸組織放入預冷的生理鹽水清洗干凈，放入凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存。

2.4 指標檢測

2.4.1 HE染色

小腸組織常規石蠟包埋，切片（厚度6 μm），經二甲苯脫蠟2次×5 min；無水乙醇浸洗2次×5 min；90%、80%、70%乙醇浸洗各5 min，蒸餾水浸5 min；蘇木精染色5 min，自來水沖洗；1%鹽酸70%乙醇分化20 s，蒸餾水浸5 min；70%、80%乙醇浸洗各5 min；90%伊紅溶液浸5 min；二甲苯浸洗2次×5 min；中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

2.4.2 小腸組織c-kit、Cx43 mRNA表達檢測

稱取大鼠小腸組織0.1 g置于無酶離心管中，加入1 mL Trizol，于冰上勻漿裂解，靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心8 min，將上清液轉入新的無酶離心管中，加入0.2 mL氯仿，冰上靜置3 min，震蕩搖勻后低溫離心（4 ℃、12 000 r/min離心15 min）；吸取上清液，加入0.5 mL異丙醇，冰上靜置10 min，低溫離心（4 ℃、12 000 r/min離心15 min）；棄上清液，可見白色沉淀，即RNA；加入1 mL 75%乙醇，充分混勻后低溫離心（4 ℃、7500 r/min離心5 min）；棄上清液，風干后加無酶水20 μL稀釋總RNA。于核酸定量分析儀測定RNA濃度，吸光度260 nm/吸光度280 nm均在1.9～2.1。進行cDNA反轉錄，PCR擴增c-kit、Cx43基因片段。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成（見表1）。以β-actin作為內參基因，反應體系及參數依據RT-PCR試劑盒說明書設置，反應參數：預變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、0.05 s，退火60 ℃、34 s，循環40次，終末延伸95 ℃、15 s，60 ℃、1 h，95 ℃、15 s。連續檢測熒光并記錄擴增曲線，采用樣點擬合法分析結果得到目的基因和β-actin的Ct值，采用比較Ct值法計算相對表達量：ΔΔCt＝（測試組目的基因Ct值－測試組內參基因Ct值）－（對照組目的基因Ct值－對照組內參基因Ct值），相對表達量為2-ΔΔCt。

表1 PCR各基因引物序列

基因名稱引物序列產物長度/bp β-actinF：5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3'150 R：5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3' c-kitF：5'-GAAGCAGATCTCAGACAGCAGCA-3'180 R：5'-CCATCGGGCTCCGTTTCTAC-3' Cx43F：5'-TGAAGTTCAGACAAGGCTCAAAGA-3'146 R：5'-ATGTTGATAGAAGCCGTTTGGTG-3'

2.4.3 小腸組織c-kit、Cx43蛋白表達檢測

稱取大鼠小腸組織0.1 g置于EP管中，加入1 mL RIPA裂解液勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取部分上清液進行BCA蛋白定量實驗，其余上清液加入5×上樣緩沖液，充分混勻后，100 ℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫，4 ℃、14 000 r/min離心5 min；取上清液，-80 ℃保存；SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，孵育一抗（一抗溶液配制：β-actin抗體溶液1∶1000，c-kit抗體溶液1∶800，Cx43抗體溶液1∶500），4 ℃過夜，1×TBST洗3次，HRP標記羊抗兔二抗（二抗溶液配制：辣根酶標記山羊抗兔1∶10 000），室溫孵育2 h；1×TBST洗3次，采用化學發光底物進行化學發光，顯影后用Bio-Rad Quantity one圖像分析軟件進行掃描分析。

3 統計學方法

4 結果

4.1 HE染色結果

空白組大鼠小腸組織結構完整，可見形態完整環形肌、黏膜肌層及豐富的小血管，腸絨毛、中央乳糜管、杯狀細胞形態完整，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠小腸結構被破壞，無完整絨毛、中央乳糜管、腸腺結構，有大量炎性細胞浸潤；各給藥組大鼠情況好轉，可見較正常的腸絨毛、中央乳糜管等結構，炎性細胞浸潤減少；與陽性對照組比較，HPS高劑量組明顯好轉，且優于HPS低、中劑量組。結果見圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織形態（HE染色，×100）

4.2 紅芪多糖對模型大鼠小腸組織c-kit、Cx43 mRNA和蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠小腸組織c-kit、Cx43 mRNA和蛋白表達均明顯降低，差異有統計學意義（＜0.01）；與模型組比較，HPS高、中劑量組和陽性對照組大鼠小腸組織c-kit、Cx43 mRNA和蛋白表達均明顯升高，差異有統計學意義（＜0.05，＜0.01），HPS高劑量組升高最明顯。結果見表2、圖2。

表2 各組大鼠Cx43、c-kit基因和蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，△＜0.05，△△＜0.01

注：K.空白組；M.模型組；Y.陽性對照組；G. HPS高劑量組； Z. HPS中劑量組；D. HPS低劑量組

5 討論

DGP是一種以胃腸動力障礙，胃排空延遲為表現的糖尿病常見消化道慢性并發癥之一。DGP屬中醫學“痞滿”范疇，基本病機為中焦氣機逆亂，升降失調，虛實夾雜為主[9]。DGP不僅引起消化道癥狀，使患者出現營養不良等表現，還可影響患者對血糖控制和藥物吸收，進而加重病情，繼發代謝失常和心、腦、腎等器官損傷，嚴重影響患者生活質量。

ICC作為胃腸基本電節律的起搏細胞[10-11]，是連接胃腸道內小腸神經系統（enteric nerve system，ENS）和平滑肌（smooth muscle cell，SMC）的中介細胞，因此，ICCs在胃腸道蠕動中發揮著至關重要的作用。由于小腸神經直接作用于ICCs，ICCs與平滑肌之間存在著廣泛的縫隙連接（gap junction，GJ）[12]，信號由ICC通過GJ傳遞給SMC，如細胞間連接被破壞，會導致ENS-ICC-SMC之間信息和物質傳遞障礙，電傳導減弱，ICCs功能受損，導致SMC調節減弱，可能是小腸動力障礙發生的機制之一[13]。c-kit為ICCs表達受體，幾乎所有ICCs均表達c-kit，因此ICCs的生長發育、表型維持和功能活動均受其特異性抗體c-kit的影響，若c-kit表達異常，則會直接導致ICCs分化異常，引起ICC與GJ、ICC與ICC、ICC與SMC之間一系列的傳導異常。縫隙連接蛋白是構成GJ的基本結構和功能蛋白，Cx43是人類主要的縫隙連接蛋白[14]。Cx43作為胃腸運動功能活動整合協調的主要結構之一，是腸道網絡的重要功能型縫隙連接通道蛋白。縫隙連接蛋白數目的減少及縫隙連接網狀結構的破壞，能抑制平滑肌細胞的興奮性，導致平滑肌收縮降低[15]。因此，c-kit、Cx43表達降低可能是導致DGP小腸動力障礙發生的機制之一。

紅芪為豆科植物多序巖黃芪的干燥根，其最早記錄于《神農本草經》黃芪項下，列為上品。2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）載紅芪補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌[6]，與黃芪同為補氣之要藥。現代藥理研究表明，紅芪有效成分HPS具有抗腫瘤、抗氧化活性、免疫調節作用[5]。研究發現，HPS能有效遏制糖尿病視網膜病變進程中新生血管生成及增殖，有效保護視網膜[16]；還可減輕糖尿病模型小鼠心肌病心肌纖維化程度[17]。同時，本課題組前期研究表明，HPS可提高GK糖尿病胃輕癱大鼠胃竇組織RhoA、MYPT1、p-MYPT1 mRNA和蛋白表達，降低GK糖尿病胃輕癱大鼠血糖，促進胃排空，增加胃泌素、胃動素等胃激素含量[18]；HPS還可通過調節抑制凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax含量的變化即Bcl-2/Bax比值，調節GK大鼠胃竇組織胃黏膜細胞凋亡率[19]；HPS對2型糖尿病大鼠可降低血糖，抑制三酰甘油、血清總膽固醇、低密度脂蛋白升高和高密度脂蛋白降低，提高胰島素敏感性指數，減弱胰島素抵抗，從而緩解2型糖尿病大鼠病情并防止并發癥的發生[20]。

本實驗通過一次性大劑量腹腔注射STZ聯合高糖高脂飼料不規則喂養方式成功復制DGP模型，DGP大鼠血糖明顯升高，出現腹部脹大、多飲多尿等表現，HE染色結果見小腸正常結構被破壞，大量炎性細胞浸潤等，小腸組織c-kit、Cx43 mRNA和蛋白表達降低，這可能是導致小腸動力障礙的原因之一。高劑量HPS可顯著減少小腸組織炎性細胞浸潤，恢復小腸組織腸絨毛、中央乳糜管等結構，升高c-kit、Cx43 mRNA和蛋白的表達，且效果優于低、中劑量HPS和莫沙必利。

綜上，HPS治療DGP腸動力的機制可能是通過上調c-kit、Cx43 mRNA和蛋白的表達，促進GJ和ICCs之間的連接，從而加強ENS-ICC-SMC信息和物質傳遞，使胃腸蠕動增強，小腸動力增加，緩解DGP癥狀，這不僅為中藥治療糖尿病胃輕癱提供新思路和客觀依據，也可為本課題組對DGP胃腸動力障礙的深層次機制研究提供實驗依據。

[1] CHEN Y, XUJ J, LIU S, et al. Electroacupuncture at ST36 ameliorates gastric emptying and rescues networks of interstitial cells of Cajal in the stomach of diabetic rats[J]. PLoS One,2013, 8(12)：e83904.

[2] TACK J, CAMILLERI M, CHANG L, et al. Systematic review：cardiovascular safety profile of 5-HT4 agonists developed forgastrointestinal disorders[J]. Alimentary Pharmacology Therapeutics,2012,35(7)：745-767.

[3] ZHANG C M, HUANG X, LU H L, et al. Up-regulation of the Ang Ⅱ/AT1 receptor may compensate for the loss of gastric antrum ICC via the PI3k/Akt signaling pathway in STZ-induced diabetic mice[J]. Molecular and Cellular Endocrinology,2016,423：77-86.

[4] HUIZINGA J D, CHEN J H. Interstitial cells of Cajal：update on basic andclinical science[J]. Current Gastroenterology Report, 2014,16：363.

[5] 陳茂鑫,侯敏.黃芪與紅芪化學成分及藥理作用研究進展與比較[J].中醫藥導報,2019,25(8)：126-128.

[6] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社,2015：152.

[7] 李厚達.實驗動物學[M].北京：中國農業出版社,2003.

[8] 陳奇.中藥藥理研究方法學[M].北京：人民衛生出版社,2006：31.

[9] 魏昭暉,萬生芳,王曉麗.基于“氣機升降”理論探析糖尿病胃輕癱[J].中醫研究,2019,32(1)：64-65.

[10] HUIZINGA J D, ROBINSON T L, THOMSEN L. The search for the origin of rhythmicity in intestinal contraction；from tissue to single cells[J]. Neurogastroenterology and Motility,2000,12(1)：3-9.

[11] THOMSEN L, ROBINSON T L, LEE J C, et al. Interstitial cells of Cajal generate a rhythmic pacemaker current[J]. Nat Med,1998, 4(7)：848-851.

[12] 常宗宏,鄧尚新,楊娟,等.Cajal間質細胞在胃腸動力障礙性疾病中的研究[J].胃腸病學和肝病學雜志,2019,28(4)：387-388.

[13] MARQUEZ-ROSADO L, SOLAN J L, DUNN C A, et al. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2012,1818(8)：1985- 1992.

[14] 劉佳麗,陳萌,張冬梅,等.Cx43在調節胃腸運動障礙機制中的研究進展[J].現代生物醫學進展,2016,23(16)：4577-4579.

[15] SEKI K, KOMURO T. Immunocytochemical demonstration of the gap junction proteins connexin 43 and connexin 45 in the musculature of the rat small intestine[J]. Cell and Tissue Research,2001, 306(3)：417-422.

[16] 張花治,金智生,劉瑩,等.紅芪多糖對糖尿病大鼠視網膜血小板反應蛋白-1和血小板源性生長因子-B表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志, 2017,24(3)：38-42.

[17] 王東旭,金智生,張花治,等.紅芪多糖對模型小鼠糖尿病心肌病心肌纖維化和基質金屬蛋白酶2及其抑制劑表達的影響[J].中國中醫藥信息雜志,2017,24(4)：57-60.

[18] 萬生芳,李雅琪,舒暢,等.紅芪多糖對GK糖尿病胃輕癱大鼠胃竇組織MYPT1/p-MYPT1蛋白表達的影響[J].時珍國醫國藥,2019,30(1)：33-36.

[19] 王曉麗,萬生芳,魏昭暉,等.紅芪多糖對脾虛型糖尿病大鼠Bcl-2/Bax表達的影響[J].時珍國醫國藥,2019,30(8)：1803-1804.

[20] 邵紅亮,溫婭娜,萬生芳,等.紅芪多糖對2型糖尿病大鼠血脂代謝紊亂及胰島素抵抗的影響[J].甘肅科技,2018,34(10)：100-101.

Effects of Hedysarum Polybotrys Polysacchcaide on Expressions of c-kit, Cx43 Gene and Protein in Small Intestine of Diabetic Gastroparesis Rats

WEI Zhaohui1, WAN Shengfang1, SHU Chang1, WANG Qiulan1, LI Rongke1, ZHANG Lei1,WANG Xiaoli2, HE Yunliang1, MA Xinxin1, GUO Qian1

To observe the effects of Hedysarum polybotrys polysacchcaide (HPS) on the expressions of tyrosine kinase receptor c-kit, gap junction protein Cx43 and protein in the small intestine of diabetic gastroparesis (DGP) rats; To investigate the mechanism of HPS on intestinal motility disorders in DGP rats.The DGP model was duplicated by a single high-dose intraperitoneal injection of STZ combined with high-sugar and high-fat diets. 72 Wistar male rats were randomly divided into blank group, model group, positive control group, HPS high-, medium-, and low-dosage groups, with 12 rats in each group. The positive control group was administrated with 0.7 g/(kg?d) of Mosabilli, and HPS high-, medium-, and low-dosage groups were administered with HPS at 0.2, 0.1, 0.05 g/(kg?d), respectively. Blank group and model group were given equal volume of pure water for gavage, once a day for 8 weeks continuously. The pathological structure of the small intestine was observed by HE staining; the expressions of c-kit, Cx43 mRNA and protein in the small intestine were detected by RT-PCR and Western blot, respectively.HE staining results showed that the normal structure of the small intestine in the model group was destroyed, and a large number of inflammatory cells were infiltrated. After administration, the condition of the rats in each administration group improved, showing that the inflammatory cell infiltration was reduced compared with the normal intact villi and central lacteal ducts and other structures; the HPS high-dosage group improved significantly. Compared with the blank group, the expressions of c-kit, Cx43 mRNA and protein in the small intestine tissue of the model group rats were significantly reduced (<0.01). Compared with the model group, the expressions of c-kit, Cx43 mRNA and protein in the small intestine of rats in each administration group significantly increased (<0.05，<0.01), and HPS high-dosage group showed the most obvious effects.HPS can increase the expressions of c-kit, Cx43 mRNA and protein of small intestine motility and improve the intestinal motility of DGP model rats.

diabetic gastroparesis; Hedysarum polybotrys polysacchcaide; c-kit; Cx43; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)08-0046-05

10.3969/j.issn.1005-5304.202001159

國家自然科學基金（81560718）；甘肅省中醫藥管理局科研課題（GZK-2017-3）

萬生芳，E-mail：wanshengfang@163.com

（2020-01-10）

（2020-02-13；編輯：華強）