梅花配方顆粒超高效液相色譜指紋圖譜及一測多評法研究

吳文平，何民友，吳淑珍，魏梅，孫冬梅，陳向東，李國衛

梅花配方顆粒超高效液相色譜指紋圖譜及一測多評法研究

吳文平，何民友，吳淑珍，魏梅，孫冬梅，陳向東，李國衛

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

建立梅花配方顆粒超高效液相色譜指紋圖譜，并應用一測多評法同時測定梅花配方顆粒中綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁含量，為其質量控制提供依據。采用Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm），以甲醇-0.1%磷酸為流動相進行梯度洗脫，流速0.25 mL/min，檢測波長355 nm，柱溫40 ℃，進樣量1 μL，測定11批梅花配方顆粒的指紋圖譜，建立指紋圖譜共有模式。采用一測多評法，以金絲桃苷為內參物，通過相對校正因子測定綠原酸、異槲皮苷、蘆丁含量，同時采用外標法測定11批梅花配方顆粒中4個指標成分的含量，比較計算值與實測值的差異，驗證一測多評法的準確性。11批梅花配方顆粒指紋圖譜標定了13個色譜峰，指認了其中6個化學成分。11批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.99。建立相對校正因子重現性良好，采用相對校正因子計算的含量值與實測值之間無明顯差異。本研究建立的測定方法簡便快捷、準確、重復性良好，可為梅花配方顆粒的質量控制和評價提供依據。

梅花配方顆粒；指紋圖譜；一測多評法；金絲桃苷；異槲皮苷；綠原酸；蘆丁

2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）收載梅花為薔薇科植物梅（Sieb.）Sieb. et Zucc.的干燥花蕾[1]。其性平，微酸，歸肝、胃、肺經，具有疏肝和中、化痰散結功效，主治肝胃氣痛、胸悶、梅核氣、暑熱煩渴、食欲不振、妊娠嘔吐、瘰疬結核、痘疹[3]。梅花化學成分復雜，國內外對白梅花化學成分有一定研究，從梅花中分離得到揮發油類、黃酮類、酚苷類、酯苷類、苯丙素類等，其中以金絲桃苷為代表的黃酮類和以綠原酸為代表的苯丙素類成分含量較高。張清華[4]從白梅花中分離并鑒定了10個黃酮類化合物。Yoshikawa等[5]從白梅花中首次分離出2個黃酮醇寡糖2″-O-乙酰蘆丁、2″-O-乙酰基-3'-O-甲基蘆丁。目前研究主要集中在含量測定方面[6]，而對梅花特征圖譜的研究較少。

一測多評法只需測定一個成分（對照品易得）即可實現多個成分同時測定[7]，可以有效解決質量分析過程中由于對照品短缺帶來的困難。因此，本研究將梅花配方顆粒的指紋圖譜和一測多評法相結合，采用超高效液相色譜法（UPLC）建立指紋圖譜及綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁定量分析方法，定性、定量考察梅花配方顆粒的質量，為建立梅花配方顆粒的質量標準提供依據。

1 儀器與試藥

Waters H-Class型超高液相色譜儀、Thermo Vanquish型超高效液相色譜儀，Agilent 1290Ⅱ型超高效液相色譜儀；XP26百萬分之一電子天平、ME204E型萬分之一電子天平、千分之一天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-QDirect型超純水系統，默克股份有限公司。

綠原酸對照品（批號110753-201817，含量96.8%）、金絲桃苷對照品（批號111521-201708，含量95.1%）、異槲皮苷對照品（批號111809-201403，含量92.9%）、蘆丁對照品（批號100080-201811；含量91.7%），中國食品藥品檢定研究院；11批梅花配方顆粒（批號S1～S11），廣東一方制藥有限公司實驗室自制；甲醇（色譜純），默克股份有限公司；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm），流動相A為甲醇、B為0.1%磷酸，梯度洗脫（0～10 min，13%A；10～11 min，13%A→21%A；11～35 min，21%→23%A；35～43 min，23%→40%A；43～45 min，40%→100%A；45～47 min，100%A；47～47.1 min，100%→13%A；47.1～55 min，13%A），流速0.25 mL/min，檢測波長355 nm，柱溫40 ℃，進樣量1 μL。

2.2 對照品溶液制備

取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁濃度分別為780、80、90、90 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

梅花配方顆粒研細，取約0.1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗

取梅花配方顆粒（批號S1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測得共有峰的相對峰面積和相對保留時間RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗

取梅花配方顆粒（批號S1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、3、8、12、18、24 h進樣測定，測得共有峰的相對峰面積和相對保留時間RSD均小于2%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗

取梅花配方顆粒（批號S1），按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，測得共有峰的相對峰面積和相對保留時間RSD均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜分析與評價

2.5.1 樣品測定

取11批梅花配方顆粒樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄UPLC圖譜。

2.5.2 共有峰的確定

采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012.0版）對11批梅花配方顆粒的UPLC指紋圖譜進行分析，時間窗口寬度設為0.1 min，多點校正，全譜峰匹配，建立各自指紋圖譜并生成指紋圖譜共有模式，標定共有峰13個。以7號峰（金絲桃苷）為參照峰（S），對照圖譜見圖1。11批梅花配方顆粒樣品共有峰的相對峰面積見表1。可以看出，不同批次樣品各色譜峰的相對峰面積相差比較大，表明不同批次的梅花配方顆粒UPLC指紋圖譜存在一定差異。

注：1.新綠原酸；2.綠原酸；7.金絲桃苷；9.異槲皮苷；10.蘆丁；12.異綠原酸C

表1 11批梅花配方顆粒UPLC指紋圖譜相對峰面積

批號12345678910111213 S10.536.280.570.480.370.421.000.531.481.420.480.270.29 S20.584.630.620.310.320.351.000.631.821.700.160.250.29 S30.504.550.610.300.270.461.000.411.651.150.280.200.22 S40.607.410.850.370.340.421.000.541.441.340.390.270.32 S50.596.940.770.350.340.441.000.511.541.330.360.250.30 S60.524.720.560.300.290.451.000.441.811.270.260.210.24 S70.575.350.780.330.290.421.000.501.521.270.320.230.26 S80.648.000.850.370.370.431.000.561.481.440.390.280.33 S90.514.820.590.320.270.351.000.571.621.390.240.220.23 S100.678.520.890.360.370.431.000.551.501.470.390.280.35 S110.676.950.860.350.350.471.000.451.541.310.410.270.32

2.5.3 相似度評價

采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012.0版）對11批梅花配方顆粒樣品指紋圖譜進行疊加，考察色譜峰相似度的一致性，進行相似度評價，結果見圖2、表2。不同批次梅花配方顆粒樣品的相似度均大于0.99，表明樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度較高，共有峰在各樣品中均能穩定出現，且吻合度較好，因此，該圖譜可做為梅花配方顆粒的指紋圖譜。

圖2 11批梅花配方顆粒UPLC指紋圖譜疊加圖

表2 11批梅花配方顆粒樣品指紋圖譜相似度（r）

批號相似度 批號相似度 S10.996 S70.999 S20.999 S81.000 S30.990 S91.000 S40.999 S101.000 S51.000 S111.000 S61.000 對照1.000

2.5.4 化學成分指認

采用“2.1”項下色譜條件分別對供試品溶液和對照品溶液進行檢測，通過與對照品色譜峰保留時間進行比對，共確定6個化合物，分別為新綠原酸（峰1）、綠原酸（峰2）、金絲桃苷（峰7）、異槲皮苷（峰9）、蘆丁（峰10）、異綠原酸C（峰12）。混合對照品及供試品色譜圖見圖3。

注：A.混合對照品；B.供試品；1.新綠原酸；2.綠原酸；7.金絲桃苷；9.異槲皮苷；10.蘆丁；12.異綠原酸C

2.6 一測多評法測定指標成分含量

2.6.1 色譜條件及供試品溶液制備

同“2.1”“2.3”項下。

2.6.2 線性關系考察

分別精密稱取綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁對照品40.128、5.206、4.144、5.160 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作為對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液0.1、0.5、1、2、5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度線，即得混合對照品溶液。精密吸取上述混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，以峰面積和對照品濃度（μg/mL）進行回歸處理，得各成分回歸方程及線性范圍，見表3。

表3 梅花配方顆粒中4種成分線性關系考察結果

成分回歸方程r2線性范圍/（μg/mL） 綠原酸Y＝17.142 9X－10.460 80.999 938.844～3884.4 金絲桃苷Y＝7.354 9X＋0.078 40.999 8 3.941～394.094 異槲皮苷Y＝7.136 5X0.999 9 4.794～179.364 蘆丁Y＝9.171 6X＋0.052 20.999 9 4.787～478.431

2.6.3 精密度試驗

分別精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積，計算綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁峰面積RSD，結果分別為0.37%、0.43%、0.36%、0.50%，表明儀器的精密度良好。

2.6.4 穩定性試驗

分別精密吸取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、3、8、12、18、24 h進樣測定，記錄峰面積，計算綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁峰面積RSD，結果分別為0.28%、0.56%、0.37%、0.28%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.6.5 重復性試驗

按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁含量RSD，結果分別為0.66%、0.61%、0.63%、0.65%，表明方法的重復性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗

取已知含量的梅花配方顆粒（批號S5）0.05 g，共9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別按0.5∶1、1∶1、1.5∶1比例精密加入混合對照品溶液（含金絲桃苷386.11 μg/mL、異槲皮苷509.84 μg/mL、蘆丁649.51 μg/mL）及綠原酸對照品固體，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、綠原酸的加樣回收率，結果見表4～表7。

表4 金絲桃苷加樣回收率試驗

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.050 530.331 50.191 60.529 3103.26 0.051 970.340 90.191 60.533 3100.42 0.052 150.342 10.191 60.534 9100.66 0.053 030.347 90.383 10.739 0102.09 0.050 090.328 60.383 10.709 5 99.42101.971.43 0.052 120.341 90.383 10.733 7102.27 0.059 050.387 40.574 70.979 3103.01 0.059 650.391 30.574 70.984 7103.26 0.058 050.380 80.574 70.974 8103.37

表5 異槲皮苷加樣回收率試驗

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.050 530.481 00.254 90.739 1101.23 0.051 970.494 80.254 90.747 7 99.24 0.052 150.496 50.254 90.748 9 99.02 0.053 030.504 80.509 81.027 3102.48 0.050 090.476 90.509 80.979 7 98.64100.931.51 0.052 120.496 20.509 81.015 7101.90 0.059 050.562 20.764 81.343 9102.22 0.059 650.567 90.764 81.346 8101.85 0.058 050.552 60.764 81.331 4101.83

表6 蘆丁加樣回收率試驗

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.050 530.592 20.324 80.924 5102.32 0.051 970.609 10.324 80.936 1100.69 0.052 150.611 20.324 80.942 7102.06 0.053 030.621 50.649 51.292 3103.28 0.050 090.587 10.649 51.239 3100.42102.491.22 0.052 120.610 80.649 51.277 9102.70 0.059 050.692 10.974 31.702 0103.66 0.059 650.699 10.974 31.708 3103.58 0.058 050.680 30.974 31.691 0103.74

表7 綠原酸加樣回收率試驗

取樣量 /g樣品中含量 /mg加入量 /mg測得量 /mg回收率 /%平均回收率 /%RSD /% 0.050 534.689 22.356 17.008 3 98.43 0.051 974.822 82.355 17.248 3102.99 0.052 154.839 52.453 97.323 8101.24 0.053 034.921 24.786 89.695 1 99.73 0.050 094.648 44.607 79.191 6 98.60100.361.40 0.052 124.836 74.655 19.501 6100.21 0.059 055.479 87.246 412.818 7101.28 0.059 655.535 56.843 812.403 6100.36 0.058 055.387 07.281 312.697 9100.41

2.6.7 相對校正因子計算

采用多點校正法計算相對校正因子，AC＝A/C＝（CA/AA）/（CC/AC）＝（CA×AC）/（CC×AA），式中，AC為內參物C峰面積，CC為內參物C濃度，AA為待測成分A峰面積，CA為待測成分A濃度。

取“2.6.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以金絲桃苷為內參物，根據公式分別計算異槲皮苷、蘆丁、綠原酸的相對校正因子，結果見表8。

表8 梅花配方顆粒中3種成分相對校正因子

序號f異槲皮苷/金絲桃苷f蘆丁/金絲桃苷f綠原酸/金絲桃苷 10.963 71.218 32.243 7 20.965 71.254 12.252 5 30.969 91.243 72.257 9 40.970 51.248 42.272 6 50.968 31.245 52.304 6 60.970 41.247 12.328 1 平均值0.968 11.242 92.276 6 RSD/%0.291.011.45

2.6.8 相對校正因子重現性考察

精密量取混合對照品溶液1 μL，按“2.2”項下色譜條件測定，分別考察不同色譜儀、色譜柱、柱溫及流速對相對校正因子的影響，結果見表9。

表9 不同色譜條件對相對校正因子的影響

色譜條件f異槲皮苷/金絲桃苷f蘆丁/金絲桃苷f綠原酸/金絲桃苷 色譜儀 Waters H-Class0.965 61.242 52.263 4 Agilent 12900.959 91.248 32.139 1 Thermo Vanquish0.973 31.251 22.228 8 柱溫 38 ℃0.957 71.231 72.245 2 42 ℃0.973 51.265 92.242 8 40 ℃0.968 71.249 12.243 8 色譜柱 Waters BEH C18-10.972 11.251 42.239 3 Waters BEH C18-20.970 81.251 22.236 2 Waters BEH C18-30.968 71.249 12.243 8 流速 0.23 mL/min0.968 71.249 12.243 8 0.25 mL/min0.963 11.239 62.247 1 0.27 mL/min0.973 31.255 82.245 7 平均值0.968 01.248 72.234 9 RSD/%0.550.671.40

2.6.9 待測色譜峰定位

采用待測成分與金絲桃苷保留時間的相對值作為定位標準，計算不同色譜儀、色譜柱、柱溫和流速條件下的綠原酸、異槲皮苷、蘆丁的相對保留時間，結果各待測成分保留時間RSD均小于3%，表明重現性較好，見表10。

表10 一測多評法待測成分色譜峰定位（相對保留時間）

色譜條件綠原酸金絲桃苷異槲皮苷蘆丁 色譜儀 Waters H-Class0.269 21.000 01.096 91.144 3 Agilent 12900.257 71.000 01.094 91.143 1 Thermo Vanquish0.247 41.000 01.093 21.137 4 柱溫 38 ℃0.257 51.000 01.088 51.121 0 42 ℃0.259 61.000 01.093 61.141 2 40 ℃0.256 11.000 01.094 71.143 5 色譜柱 Waters BEH C18-10.258 01.000 01.094 21.142 8 Waters BEH C18-20.256 71.000 01.094 41.142 5 Waters BEH C18-30.256 11.000 01.094 81.143 6 流速 0.23 mL/min0.256 11.000 01.094 71.143 5 0.25 mL/min0.260 31.000 01.093 51.130 6 0.27 mL/min0.250 01.000 01.095 81.148 6 平均值0.257 7 1.094 11.140 2 RSD/%2.07 0.190.65

2.6.10 一測多評法與外標法測定結果比較

取11批梅花配方顆粒樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析，分別采用外標法和一測多評法計算綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁的含量。結果表明，2種方法測得數據無明顯差異，RSD均小于3%，見表11。

表11 外標法與一測多評法測定梅花配方顆粒中4種成分含量比較（mg/g）

批號金絲桃苷（外標法） 綠原酸 異槲皮苷 蘆丁 外標法一測多評法RSD/% 外標法一測多評法RSD/% 外標法一測多評法RSD/% S1 6.14 85.20 85.990.65 8.85 8.661.53 10.8510.990.91 S2 9.21 95.68 96.570.65 16.5516.191.56 19.8720.130.92 S3 9.93 94.93 95.810.65 16.2815.931.54 14.2114.390.89 S4 6.38 102.81103.760.65 9.03 8.831.58 10.9211.060.90 S5 6.56 92.80 92.770.02 9.52 9.291.73 11.7211.521.22 S610.10 105.17106.150.66 18.1517.761.54 15.5615.760.90 S7 8.19 101.36102.300.65 12.2511.991.52 13.1213.290.91 S8 6.23 108.93109.940.65 9.31 9.101.61 11.2311.370.88 S9 9.50 100.63101.560.65 15.3214.991.54 16.9217.140.91 S10 6.01 109.89110.910.65 8.99 8.791.59 11.1011.250.95 S11 5.95 95.68 96.570.65 9.09 8.911.41 10.4410.772.20

3 討論

本研究對色譜條件進行了考察：比較甲醇、乙腈與不同濃度的磷酸、甲酸溶液組合的流動相體系，發現甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫效果最佳；采用PDA檢測器對供試品溶液在200～400 nm范圍內進行全波長掃描，結果綠原酸、金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁在波長355 nm處均有較強的紫外吸收峰，故選擇355 nm為測定波長；考察不同色譜柱，發現Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）分離效果最佳。

含量測定結果顯示，4種成分的含量在不同批次樣品間相差不大，表明梅花配方顆粒的質量相對穩定；外標法與一測多評法所得結果無明顯差異，表明本研究建立的一測多評法能夠代替外標法對梅花配方顆粒進行質量控制。

中藥有效成分繁多，單一成分難以準確評價配方顆粒的質量，一測多評法是多指標質量控制方法之一，將一測多評法與指紋圖譜法相結合，能對配方顆粒進行客觀、全面的質量控制。本研究建立的UPLC指紋圖譜及含量測定方法簡單快捷、重復性好、準確度高，可為梅花配方顆粒質量標準的制定提供依據。

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Study on UPLC Fingerprints and QAMS of Mume Fols Dispensing Granules

WU Wenping, HE Minyou, WU Shuzhen, WEI Mei, SUN Dongmei, CHEN Xiangdong, LI Guowei

To establish UPLC fingerprints of Mume Fols dispensing granules, and to determine the contents of chlorogenic acid, hypericin, isoquercetin, rutin in Mume Fols dispensing granules by quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS); To provide references for its quality control.The analysis was carried out on a Waters BEH C18 column (2.1 mm × 150 mm, 1.7 μm) with the mobile phase of methanol - 0.1% phosphoric acid at a flow rate of 0.25 mL/min in gradient elution mode; the detection wavelength was 355 nm, and the column temperature was 40 ℃. The injection volume was 1 μL. The common mode of UPLC fingerprint was established by determined of 11 batches of Mume Fols dispensing granules. A QAMS method was developed. With hypericin as the internal reference, the contents of chlorogenic acid, isoquercetin and rutin were measured by relative correction factor. External standard method was performed to determine 4 index components in 11 batches of Mume Fols dispensing granules. The difference between the calculated value and the measured value was compared to verify the accuracy of QAMS.13 common peaks were marked in the fingerprints of 11 batches of Mume Fols dispensing granules and 6 of them were identified. The similarities between the fingerprints of samples and control were all greater than 0.99. The established relative correction factor had good reproducibility, and there was no significant difference between the content value calculated using the relative correction factor and the measured value.The method is simple, rapid, accurate and repeatable, which can provide references for quality control and evaluation of Mume Fols dispensing granules.

Mume Fols dispensing granules; fingerprints; QAMS; hyperoside; isoquercitrin; chlorogenic acid; rutin

R284.1

A

1005-5304(2020)08-0086-06

10.3969/j.issn.1005-5304.201911564

廣東省省級科技計劃項目（2018B030323004）；廣東省中藥配方顆粒工程實驗室（2018年）

李國衛，E-mail：452048107@qq.com

（2019-11-30）

（2019-12-27；編輯：陳靜）