龍眼DlbZIP21基因克隆與表達分析

王金英，張樹偉，丁 峰，2*，潘介春*，彭宏祥，范志毅，趙德征，黃 幸，李 琳，王 穎，李浩然

(1.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004；2.廣西農業科學院/廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西 南寧 530007；3.廣西農業科學院園藝研究所，廣西 南寧 530007；4.廣西宏華生物實業股份有限公司，廣西 柳州 545000)

【研究意義】龍眼(DimocarpuslonganLour.)屬無患子科(Sapindaceae)龍眼屬植物，是一種重要的亞熱帶常綠果樹，因其果實營養價值高及口感美味而具有很高的商業價值。在龍眼生長發育過程中，花芽分化受多種不良環境因素的影響，致使成花率降低，進而影響龍眼的產量和經濟效益。此外，生產上種植的中熟龍眼品種較多，早、晚熟品種較少，品種結構不合理，龍眼收獲期較集中，致使龍眼果實售價偏低，也直接影響果農的經濟效益。堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)轉錄因子可直接參與植物的成花調控，如bZIP轉錄因子FLOWERINGLOCUSD(FD)可與成花關鍵基因FLOWERINGLOCUST(FT)互作調控下游基因APETALA1(AP1)和LEAFY(LFY)的表達從而促進植物成花[1]。石硤龍眼一年只能開花結果一次，而四季蜜龍眼具有一年多次開花結果特性，但目前關于bZIP轉錄因子參與龍眼成花的調控機制尚不明確。因此，分析bZIP轉錄因子基因DlbZIP21在石硤和四季蜜兩個龍眼品種不同組織和年周期表達水平的差異性，對揭示不同龍眼品種成花差異的分子調控機制及龍眼的熟期育種和產期調節具有重要意義。【前人研究進展】DlbZIP21基因為bZIP轉錄因子基因家族中的一員，具有bZIP轉錄因子的部分性質。bZIP轉錄因子在真核生物中廣泛分布且相對保守[2]，由一個堿性區域和一個bZIP結構構成，約包含20個氨基酸殘基，堿性區域相對保守，能通過固定的核定位信號結構N-(X)7-R/K與DNA順式原件特異性結合[3]。目前，已在多種植物中發現bZIP轉錄因子[2，4]，如擬南芥、高梁、蓖麻、玉米和大豆。根據bZIP堿性結構域及其他保守結構域特點，可將擬南芥中的bZIP轉錄因子家族成員分為A、B、C、D、E、F、G、H、I和S共10個亞家族[3]，不同亞族分別行使不同的功能[5]，目前許多植物bZIP亞族的分類仍以此分類方法為依據。bZIP轉錄因子可參與植物組織分化、細胞延伸、能量代謝和蛋白調控等生物學進程。bZIP53蛋白能與啟動子中的G-box元件特異性結合，同時與bZIP10或bZIP25相互作用，顯著增強與DNA的結合活性，增加靶基因的轉錄水平[6]。OsbZIP39能通過蛋白水解轉化為可溶性蛋白，從而轉移到細胞核中，OsbZIP39DC能激活水稻原生質體結合蛋白1(BiP1)的啟動子，并參與內質網應激反應[7]，缺乏SC-uORF 59-先導區的轉基因tbz17煙草植株葉片增厚，細胞增大，蔗糖含量升高[8]。Silveira等[9]研究發現，AtbZIP9轉基因植物能使葉片出現發育缺陷，誘導其不正常發育。細胞分裂素(CTK)和茉莉酸(JA)能提高ATbZIP2基因的轉錄水平，增強其表達量[10]。此外，bZIP 轉錄因子能響應逆境脅迫，在脅迫條件下植物內源脫落酸合成量增加，從而激活bZIP家族基因表達[2]。在滲透脅迫處理下，MdbZIP48轉基因擬南芥株系種子的發芽率、子葉綠化率和根長均優于野生型擬南芥[11]。Lee等[10]研究發現，鹽處理能提高ATbZIP53基因的轉錄水平和表達量；AtbZIP2和AtbZIP11基因對非生物脅迫和激素也有不同響應。【本研究切入點】bZIP轉錄因子參與擬南芥等植物的成花調控，推測DlbZIP21基因可能參與龍眼成花調控，但目前關于bZIP轉錄因子對龍眼成花影響的研究未見報道。【擬解決發關鍵問題】對從石硤和四季蜜龍眼品種中克隆得到的bZIP轉錄因子基因DlbZIP21進行生物信息學分析，通過熒光定量PCR檢測其在兩個龍眼品種不同組織和年周期中的特異性表達情況，揭示不同龍眼品種成花差異的分子調控機制，為龍眼的熟期育種和產期調節提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2019年3月分別在廣西大學龍眼試驗園和果樹標本園采集一年只開花一次的石硤龍眼和一年四季開花的四季蜜龍眼的根、莖、葉片、葉柄和花芽，在2019年5月分別采取轉色期果皮、果肉和種子等不同組織材料，于2019年1-12月每月分別采集一次石硤和四季蜜龍眼葉片作為年周期材料。各材料洗凈后放入采樣袋中，液氮速凍后帶回實驗室，-80 ℃保存備用。

采用TIANGEN多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取龍眼總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒進行cDNA鏈合成，采用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase和ExTaq?進行基因克隆PCR檢測，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒進行膠回收，采用TB GreenTMPremix ExTaqTMII試劑盒進行熒光定量PCR檢測。

1.2 DlbZIP21基因克隆

采用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的龍眼各組織總RNA純度，利用逆轉錄試劑盒反轉錄合成cDN鏈合成。根據實驗室經過3代轉錄組測序并結合龍眼基因組數據獲得的bZIP基因序列，使用Primer Premier 5.0 設計DlbZIP21特異性引物(表1)，第一階段用高保真酶進行擴增，PCR反應體系25.00 μl：PrimeSTAR Max Premix 12.50 μl，ddH2O 9.50 μl，cDNA模板及上、下游引物各1.00 μl。擴增程序：94 ℃ 預變性3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，進行35個循環；72 ℃ 延伸10 min。以第一輪PCR擴增產物為模板，利用ExTaq酶進行第二輪PCR擴增，擴增體系25.00 μl：ExTaq0.15 μl，10×ExTaqBuffer 2.50 μl，dNTP Mixture 2.00 μl，模板及上、下游引物各1.00 μl，ddH2O 17.35 μl。擴增程序：98 ℃預變性4 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物檢測純化后克隆到pMD18-T載體進行測序。

1.3 生物信息學分析

利用NCBI在線分析DlbZIP21的開放閱讀框(ORF)，同時獲得不同物種的bZIP氨基酸序列，應用BIOXM 2.6推測DlbZIP21氨基酸序列，使用ExPASy ProtParam在線工具分析DlbZIP21蛋白的理化性質，其跨膜螺旋區使用TMHMM進行預測，利用SignalP 4.1 Server在線進行信號肽預測，使用NCBI-CDD對DlbZIP21蛋白保守結構域進行預測分析，應用PSORT II Prediction在線預測亞細胞定位，使用NetPhos 3.1 Server分析DlbZIP21蛋白的磷酸化位點，利用在線分析工具SOPMA對DlbZIP21蛋白進行二級結構預測，用DNAMAN進行多序列比對，利用MEGA 6.0以鄰近相接法(Neighbour-joining)步長值1000構建系統發育進化樹。

1.4 DlbZIP21基因表達分析

采用LightCycler 480 System熒光定量PCR系統，在96孔板中進行熒光定量PCR反應。選用龍眼Actin作內參基因，根據測序所得的DlbZIP21基因序列設計定量引物(表1)，分別以石硤和四季蜜龍眼的根、莖、葉片、葉柄、花芽、果皮、果肉、種子及全年12個月的葉片cDNA為模板，采用兩步法進行熒光定量PCR擴增，反應體系20.00 μl：TB Green Premix ExTaqII 10.00 μl，上、下游引物各0.50 μl，cDNA模板1.00 μl，ddH2O 8.00 μl。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，進行40個循環；95 ℃融解5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 0 s，50 ℃降溫30 s。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量[12]，采用Excel 2010進行基因表達水平分析及制圖。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 龍眼總RNA提取及DlbZIP21基因克隆

1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明，使用總RNA提取試劑盒提取的龍眼組織RNA無降解且純度較高(圖1-A)，可用于后續試驗；根據特異性引物進行PCR擴增，目的基因為1353 bp，電泳檢測擴增產物獲得一條清晰明亮、與目的基因大小一致的條帶(圖1-B)，符合后續試驗要求，純化后連接到pMD18-T載體，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，通過篩選克隆測序，獲得龍眼DlbZIP21基因序列信息。

2.2 DlbZIP21基因編碼蛋白的理化性質

生物信息學分析結果表明，DlbZIP21-sx和DlbZIP21-sj基因的ORF均為1353 bp，各編碼450個氨基酸殘基；預測龍眼蛋白分子式分別為C2143H3433N647O695S13和C2144H3435N647O695S13，分子量分別為49.80和49.81 kD，等電點均為6.53；脂溶指數均為77.02，不穩定系數分別為62.44和62.71，屬于不穩定蛋白；親水指數分別為-0.544和-0.543，屬于疏水蛋白；帶正電殘基總數(Arg+Lys)均為49，帶負電荷殘基總數(Asp+Glu)均為51；用在線分析工具PSORT II Prediction預測DlbZIP21均定位于細胞核；SignalP 4.1 Server在線預測DlbZIP21蛋白均無信號肽，利用TMHMM在線預測DlbZIP21蛋白均無跨膜結構區。由此推測DlbZIP21蛋白合成后不經轉運，在細胞核中行使催化功能。

2.3 DlbZIP21蛋白保守結構域分析結果

以NCBI-CDS對2個DlbZIP21蛋白保守結構域進行在線預測，結果(圖2)表明，兩個DlbZIP21蛋白保守結構域相同，均屬于bZIP蛋白超家族[13]，具有調節細胞發育功能，該結構包括1個 bZIP-HBP-1b結構和1個DOG1結構域，DOG1結構域是一種特殊的植物種子休眠調節劑，具有bZIP家族典型結構特征。

M：Marker DL2000；1：石硤；2：四季蜜M：Marker DL2000；1：Shixia；2：Sijimi

圖2 DlbZIP21編碼蛋白的保守功能域Fig.3 Conserved domain of the protein encoded by the DlbZIP21

2.4 DlbZIP21蛋白磷酸化位點分析結果

蛋白磷酸化位點分析結果(圖3)顯示，DlbZIP21-sx和DlbZIP21-sj蛋白均含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3種氨基酸磷酸化位點，其中，絲氨酸磷酸化位點分別為45和44個，蘇氨酸磷酸化位點分別為14和15個，酪氨酸磷酸化位點均為2個；可能是潛在磷酸化位點的為第27位氨基酸，其閾值均為0.995；兩個蛋白中絲氨酸的磷酸化位點最多。

A：DlbZIP21-sx磷酸位點預測；B：DlbZIP21-sj磷酸位點預測A：Phosphorylation site prediction of DlbZIP21-sx；B：Phosphorylation site prediction of DlbZIP21-sj

2.5 同源氨基酸序列比對分析結果

氨基酸序列比對分析結果(圖4)表明，DlbZIP21-sx和DlbZIP21-sj蛋白的氨基酸序列與白羽扁豆(Lupinusalbus，KAE9602904.1)和大豆(Glycinemax，ABI34658.1)蛋白的氨基酸序列具有較高的一致性，相似性為72.69 %。

圖4 DlbZIP21與其他物種bZIP的氨基酸序列比對分析結果Fig.4 Sequence alignments of amino acid sequence of DlbZIP21 compared with other species

2.6 DlbZIP21蛋白系統發育進化樹分析結果

通過NCBI對DlbZIP21-sx和DlbZIP21-sj蛋白的氨基酸序列進行BLAST比對(圖5)，獲得以下屬于bZIP基因家族的成員，分別為連蕊茶(Camelliafraterna，QCQ29284.1)、茶樹(Camelliasinensis，AGO05995.1)、可可豆(Theobromacacao，EOY04829.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_173381.1)、菜豆(Phaseolusvulgaris，AAK39130.1)、大豆(Glycine max，ABI34658.1)、水稻(OryzasativajaponicaGroup，ABA96884.1)、中華獼猴桃(Actinidiachinensisvar.chinensis，PSS29131.1)、土瓶草(Cephalotusfollicularis，GAV61199.1)、澳洲棉(Gossypiumaustrale，KAA3453989.1)、白羽扁豆(Lupinusalbus，KAE9602904.1)、糙葉山黃麻(Parasponiaandersonii，PON35707.1)、甜杏仁(Prunusdulcis，BBG96166.1)和榆樹(Tremaorientale，PON58161.1)。進一步利用MEGA 6.0構建bZIP21蛋白的系統發育進化樹，結果表明DlbZIP21-sx與DlbZIP21-sj蛋白的親緣關系最近，同時與大豆、水稻和菜豆的親緣關系較近，但與擬南芥的親緣關系較遠。

圖5 基于bZIP21氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on bZIP21 amino acid sequences homology

2.7 DlbZIP21基因表達水平分析結果

為了探討DlbZIP21基因在石硤和四季蜜兩個龍眼品種不同組織和年周期表達水平的差異性，分別采集兩個龍眼品種的根、莖、葉片、葉柄、花芽、果皮、果肉和種子進行熒光定量檢測。從圖6可看出，在四季蜜龍眼各組織中均檢測到DlbZIP21基因表達，其中在花芽中的相對表達量最高，在葉柄、莖和葉片中的相對表達量次之；同時，DlbZIP21基因在全年均有表達，其中在成花階段相對表達量較高，在果實發育期相對表達量較低。在石硤龍眼中，檢測到DlbZIP21基因在葉片中相對表達量最高，在莖和花芽中的相對表達量次之；同時DlbZIP21基因在全年均有表達，其中在成花階段相對表達量較高，在果實發育階段相對表達量較低。

從圖6還可看出，在不同組織中，DlbZIP21基因在2個龍眼品種的果皮和果肉中表達量均偏低，在四季蜜龍眼花芽中的表達量較在石硤龍眼花芽表達量高5倍；在年周期中，從1-12月DlbZIP21基因在兩個利用品種中的表達量總體上呈先上升后下降再上升的變化趨勢，在四季蜜龍眼中的表達量普遍高于石硤龍眼，其中在花芽分化期和成花期(12月至翌年4月)的表達量高于石硤龍眼6～8倍；在果實采收后(8-10月)DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的表達量呈上升趨勢，說明DlbZIP21基因在四季蜜龍眼成花方面發揮了重要作用，且可能參與誘導四季蜜龍眼一年多次成花。

圖6 DlbZIP21基因在石硤和四季蜜龍眼中的不同表達水平分析結果Fig.6 Analysis results of different expression levels ofDlbZIP21 in Shixia and Sijimi

3 討 論

植物bZIP轉錄因子基因家族參與植物成花調控已被學術界廣泛認可。通過多年調查發現石硤龍眼一年只能開花結果一次，而四季蜜龍眼可一年多次開花結果，故克隆石硤和四季蜜龍眼品種的關鍵基因進行生物信息學分析及表達分析，旨在揭示龍眼的成花分子機制。已有研究表明，bZIP轉錄因子基因家族中的FD基因在植物花期開始前表達于莖尖分生組織(SAM)中，但不能單獨誘導開花，FD基因與FT基因互作對FD基因促進成花具有重要作用[1，14]。此外，在光周期作用下可誘導FT基因轉運到SAM，FT基因與FD基因互作，最終形成具有轉錄活性的FD-FT復合物，上調下游基因SOC1、AP1和LFY而促進成花[15]。目前，關于龍眼bZIP轉錄因子基因家族參與成花的研究相對較少，本研究克隆石硤和四季蜜龍眼DlbZIP21基因并分析其在龍眼不同組織和年周期的表達量，可為挖掘龍眼關鍵成花基因打下基礎。

DlbZIP21基因屬于bZIP轉錄因子基因家族成員，本研究克隆的DlbZIP21基因在石硤和四季蜜龍眼中的ORF均為1353 bp，編碼450個氨基酸，兩個品種具有相同的保守結構域；通過系統發育進化樹分析發現，DlbZIP21基因與大豆、水稻和菜豆的親緣關系較近，但與擬南芥的親緣關系較遠，表明DlbZIP21基因與豆科植物功能具有相似性，可為以后研究DlbZIP21基因的功能提供參考；進行氨基酸序列比對分析發現，不同植物間的bZIP轉錄因子基因其磷酸化位點也具有較高的一致性，通過對DlbZIP21蛋白編碼的磷酸化位點進行預測，確定其磷酸化位點包括絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，與曹紅利[16]對茶樹CsbZIP的分析結果一致。已有研究發現，在擬南芥中，一些AtbZIP基因可調節ABRE啟動子的順式元件，包括ABF1、ABF2和ABF4，同時有研究表明，CsbZIP72和CsbZIP76含有bZIP轉錄因子啟動子中識別位點的GCN_Motif順式元件(G-box)[17]，而本研究發現DlbZIP21蛋白存在一種特殊的植物種子休眠調節劑DOG1結構，能參與植物種子發育，此結構與上述研究結果相似，均可參與植物生物學進程。

本研究結果顯示，DlbZIP21基因在四季蜜和石硤龍眼不同組織中均有表達，其中在四季蜜龍眼花芽中的相對表達量高出在石硤龍眼花芽中相對表達量的5倍；在年周期中，DlbZIP21基因在兩個龍眼品種中的相對表達量總體上呈先上升后下降再上升的變化趨勢，但在四季蜜龍眼中的相對表達量普遍高于石硤龍眼，在花芽分化期和成花期(12月至翌年4月)，DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的相對表達量高于石硤龍眼6～8倍，由于四季蜜龍眼在果實采收后(8-10月)繼續開花，同時DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的相對表達量也出現上升趨勢，而一年開花一次的石硤龍眼相對表達量較低且無明顯變化，與四季蜜龍眼具有一年多次開花結果特性相吻合[18]，但具體作用機制尚需進一步探究。

4 結 論

DlbZIP21基因在四季蜜和石硤龍眼不同組織中均有表達，其中在花芽中的相對表達量四季蜜龍眼顯著高于石硤龍眼，在葉片和種子中的相對表達量表現為石硤龍眼顯著高于四季蜜龍眼；在年周期中，DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的相對表達量普遍高于石硤龍眼，其中在花芽分化期和成花期(12月至翌年4月)的相對表達量以四季蜜龍眼顯著高于石硤龍眼，在果實采收后(8-10月)DlbZIP21基因在四季蜜龍眼中的相對表達量呈上升趨勢。可見，DlbZIP21基因在誘導龍眼成花方面發揮重要作用，可能參與誘導四季蜜龍眼一年多次成花。