壯偉遠盲蚓(Amynthas robustus)和南美岸蚓(Pontoscolex corethrurus)的人工生長繁殖及其對赤紅壤碳氮磷素的影響

王皓宇，張 池，吳家龍，周 波，戴 軍

(1.華南農業大學資源環境學院/廣東省土地利用與整治重點實驗室/國土資源部建設用地再開發重點實驗室/農業部華南耕地保育重點實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣東省生態環境技術研究所，廣東 廣州 510650；3.廣東省土地開發整治中心，廣東 廣州 510635；4.廣東省農業科學院茶葉研究所/廣東省茶樹資源創新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640)

【研究意義】蚯蚓被稱為是“生態系統的工程師”[1-2]，對有機物的分解和腐殖質的形成等養分循環過程、維持和提高土壤肥力、修復退化和污染土壤有重要影響[3-4]。蚯蚓的種類豐富，不同生態型的蚯蚓對食物的偏好具有明顯差異[5]。內棲型蚯蚓主要生活在土壤5～15 cm土層，生物擾動能力高，偏好取食富含有機質的土壤，能夠很好地將有機物和土壤混合，對土壤物理結構及養分循環都有顯著的促進作用[6]。因此，探討食土內棲型蚯蚓的生長繁殖條件及其對土壤的作用是生物修復土壤技術應用的關鍵[4,7-8]。已有的蚯蚓繁殖研究較多關注于表棲型蚯蚓赤子愛勝蚓、南美岸蚓的生長繁殖[9-13]。赤子愛勝蚓取食高腐殖物質，較難在土壤中長時間生存。南美岸蚓在華南地區分布較廣，但其為入侵蚓種[14-15]，不適于大規模飼養和田間應用。因此，探明華南地區本土內層種蚯蚓的繁殖條件極其重要，國內卻鮮有報道。【前人研究進展】李翰青[16]利用13C示蹤的室內微宇宙實驗分析了Pheretimacorethrurus對凋落物和赤紅壤有機碳轉化過程的調控作用。劉賓等[17]在實驗室條件下探討了威廉腔環蚓(P.guillelmi)紅壤氮素肥力的影響。劉德輝等[18]通過盆缽生物試驗研究了秉氏環毛蚓(P.pingi.)在有機物料(稻草、花生秸、油菜秸)的紅壤共同作用下經過100 d的培養土壤全磷和有效磷的影響。【本研究切入點】目前華南地區特有蚓種A.robustus對華南地區酸性赤紅壤碳氮磷素遷移轉化的影響以及與P.corethrurus差異，至今仍不清晰。【擬解決的關鍵問題】探究P.corethrurus和A.robustus的最適有機物料，探究二者對赤紅壤碳氮磷遷移轉化的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蚯蚓為廣東優勢蚓種P.corethrurus和A.robustus，二者均為內棲型蚯蚓，采自華南農業大學樹木園內。所有蚯蚓在實驗室穩定培養一周后，選取個體大小相似，具有成熟環的健壯蚯蚓約10 g·pot-1進行實驗。供試土壤采自華南農業大學樹木園內。樣品自然風干后，過2 mm篩備用。其基本理化性質為：<0.002 mm黏粒含量為23.97 %±0.5 %，粉粒23.21 %±0.4 %，砂粒52.82 %±0.2 %，pH為4.25±0.02，有機碳和全氮分別為(26.98±0.69)、(1.85±0.05)g·kg-1，C/N為14.60±0.20。供試有機物料為牛糞和蘑菇渣，分別取自華南農業大學動科學院養殖場和廣東某蘑菇生產企業種植平菇后的下腳料，牛糞、蘑菇渣腐熟自然條件下堆置后，風干磨碎篩備用。

1.2 研究方法

本研究通過添加不同有機物料(牛糞、蘑菇渣)混合土壤(2 kg)和接種蚯蚓(約10 g)進入塑料盆缽(16 cm×18 cm)進行室內培養實驗。實驗共設置9個處理，每個處理5個重復。各處理布置如表2所示。所有處理的土壤或有機物混合土壤基質均調節水分至田間持水量60 %，25 ℃穩定24 h后，在室溫25 ℃濕度40 %的條件下進行蚯蚓接種和培養。在實驗進行期間采用稱重法調節土壤水分含量。不接種蚯蚓的對照處理也采用相同方法進行設置。隨后在培養15、30、45、60、75、90 d時，進行破壞性采樣，對蚯蚓生物量、數量進行統計。在90 d培養后對所有基質風干和研磨，分別過2和0.149 mm篩裝袋備用，以便土壤的pH、有機碳、可溶性碳、全氮、堿解氮、全磷、有效磷的測定。

表1 供試物料基本理化性質

表2 蚯蚓接種試驗設計方案

1.3 土壤理化性質測定方法

土壤pH測定選用pH 計電位法(1∶2.5 土水比)；土壤有機碳用K2Cr2O7外加熱氧化法；可溶性碳為0.5 mol·L-1K2SO4浸提，重鉻酸鉀外加熱法測定；全氮的測定采用凱氏消煮法；全磷測定采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法；有效磷采用氟化銨-鹽酸浸提后使用鉬銻抗比色法；堿解氮采用堿解擴散法[19]。

1.4 數據處理

本次試驗的數據主要使用SPSS16.0 和R統計軟件的ade4程序包進行整理和統計分析。對于蚯蚓生長繁殖狀況，主要通過方差分析(ANOVA)和鄧肯多重比較來分析不同時期各處理對于蚯蚓生長繁殖的差異；培養結束后土壤的理化屬性分析主要通過方差分析(ANOVA)對于不同處理間土壤的差異進行分析。主成分分析(Principal Components Analysis)通過在R中導入ADE-4軟件包，將各處理中相互關聯的多個變量合成少數獨立而又能反映總體信息的指標，并應用置換檢驗(Permutation test)比較不同處理間生物質量綜合特征的差異；多元數據分析結果利用二維空間載荷圖和得分圖直觀而形象地進行反映，處理間的差異顯著性水平用P=0.05表示。為了更直觀和形象的表現各指標間的相互關系，采用可視化相關分析對各指標進行進一步分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理條件下蚯蚓的生長繁殖情況

2.1.1 不同處理對蚯蚓生長的影響 在培養的前90 d，不同處理中蚯蚓的生物量均隨時間的增長呈先升高后下降的趨勢(圖1-a,b)。其中100 %S的處理中P.corethrurus接種15 d后總生物量隨時間的延長而顯著降低(P<0.05)。在培養周期內，蘑菇渣(PC3)和牛糞(PC2)處理P.corethrurus的生物量均高于空白處理(PC1)，且分別在第30和45天最高。第90天的生物量大小依次為：PC2>PC3>PC1，PC2處理蚯蚓生物量顯著高于其他兩種處理(P<0.05)。100 %S的處理中A.robustus在培養45 d時達到最大值。在培養周期內，牛糞(AR2)和蘑菇渣(AR3)處理的蚯蚓生物量均高于空白處理(AR1)，且均在75 d時有最大值，第90天的蚯蚓生物量大小依次為：AR2>AR3>AR1，AR2、AR3顯著高于AR1(P<0.05)。P.corethrurus在不同處理條件下培養第45天的生物量分別為7.42、16.38、12.48 g，除PC1處理外，PC2、PC3處理蚯蚓生物量均顯著升高，且各處理間差異極顯著(P<0.001)。A.robustus在不同處理條件第45天AR2(15.61 g)和AR3(17.45 g)處理的蚯蚓生物量均高于AR1(14.04 g)(P<0.05)。

2.1.2 不同處理對蚯蚓繁殖情況的影響 從圖1-c，d可看出,不同處理中P.corethrurus數量在培養周期內隨時間的推移呈先平穩后下降的趨勢，PC2與PC3處理差異顯著(P<0.05)，處理PC2、PC1蚯蚓數量在30 d時有小的漲幅，之后隨著時間的延長而遞減；A.robustus隨時間的延長變化相對平穩，處理AR1、AR3在45 d時出現數量下降趨勢，而AR2數量在90 d內未發生變化。

圖1 不同處理蚯蚓生長繁殖情況Fig.1 The growth and fecundity of earthworms under different treatments

2.1.3 不同處理下蚯蚓生物學特征的定量比較 如表3所示，在第90天時，PC2處理P.corethrurus的存活率顯著高于PC3和PC1處理(P<0.01)。A.robustus接種90 d后存活率極高，且各處理間差異不顯著，其中AR2處理存活率為100 %。培養結束后PC2處理P.corethrurus的失重率(18.44 %)顯著低于PC3(55.36 %)和PC1(71.72 %)處理(P<0.01)。AR1處理A.robustus的失重率(7.40 %)顯著高于AR2(-47.25 %)和AR3(-38.30 %)處理(P<0.05)。P.corethrurus在3種處理下最大單體重為PC3(0.60 g)>PC2(0.47 g)>PC1(0.34 g)，且各處理差異極顯著(P<0.01)。A.robustus在3種處理下最大單體重分別為AR1(4.68 g)、AR2(5.30 g)、AR3(5.24 g)，各處理間差異不顯著，AR2處理得到最大單體重。

表3 兩種蚯蚓在不同物料中存活、生長情況的定量比較

2.1.4 2種蚯蚓生長特性主成分分析 如圖2所示，第一主成分(Ax1)和第二主成分(Ax2)的累積方差貢獻率達到99.7 %。其中：第一主成分(Ax1)的方差貢獻率為93.3 %，與存活率、生物量和失重率密切相關(P=0.001)。蚯蚓處理PC和AR生物學性質差異主要體現在第一主成分上。相關分析結果顯示(圖5)：蚯蚓的生物量與存活率之間有顯著正相關關系(P<0.05)，生物量與失重率之間有顯著負相關關系(P<0.05)。

圖2 生物學特征主成分分析Fig.2 Principal component analysis of biological properties in treatments

2.2 蚯蚓對土壤理化性質的影響

不同有機物料處理中不同蚯蚓對土壤pH影響有明顯差異。由圖3-a可以看出，在不添加物料的處理中，2種蚯蚓均使土壤pH增高，其中PC1和AR1處理的pH值分別高于不添加蚯蚓CK1處理0.31、0.27，且達到顯著水平(P<0.05)。在添加牛糞的處理中，AR2的pH顯著高于CK2處理0.17，而PC2的pH顯著低于CK2處理0.66。在添加蘑菇渣處理中，兩種蚯蚓活動均使土壤pH降低，PC3與AR3的pH和CK3處理相比分別下降0.32、0.38(P<0.05)。100 %S的處理中PC1、CK1的有機碳含量比AR1分別顯著提高了3.34、2.06 g·kg-1(P<0.05)；5 %Ma+95 %S的處理中CK2有機碳含量最高，PC2和AR2有機碳含量分別比CK2顯著降低了5.87、8.02 g·kg-1(P<0.05)；5 %Mc+95 %S的處理中PC3有機碳含量最高，比CK3和AR3顯著增加了10.55、6.92 g·kg-1(圖3-b；P<0.05)。對于可溶性有機碳，蚯蚓作用后的土壤可溶性有機碳均顯著降低(圖3-e；P<0.05)，與各自對應的空白處理相比較，5 %Mc+95 %S處理中蚯蚓活動后DOC含量下降率最大(PC3下降85.71 %，AR3下降93.23 %)，100 %S處理蚯蚓活動后DOC下降水平居于其次(PC1下降84.85 %，AR1下降87.88 %)，5 %Ma+95 %S處理DOC下降率最低(PC2下降72.04 %，AR2下降87.10 %)。全氮含量比較中其情況與有機碳變化趨勢一致。100 %S的處理中PC1>CK1>AR1(P<0.05)；5 %Ma+95 %S的處理中CK2>PC2>AR2(P<0.05)；5 %Mc+95 %S的處理中PC3全氮含量最高，比CK3和AR3分別高出0.63、0.42 g·kg-1(圖3-c；P<0.05)。對于堿解氮，100 %S的處理中添加蚯蚓的堿解氮含量均上升，PC1相比CK1處理提高72.8 mg·kg-1(圖3-f；P<0.05)；5 %Ma+95 %S的處理中PC2、AR2處理堿解氮含量與CK2相比分別下降28、11.67 mg·kg-1。

有效磷比較中，100 %S的處理中添加蚯蚓的有效磷含量均上升，且PC1處理的有效磷差異顯著(圖3-g；P<0.05)；5 %Ma+95 %S的處理中PC2、AR2處理有效磷含量與CK2相比都有下降，AR2下降達到極顯著差異(P<0.01)；5 %Mc+95 %S的處理中PC3、AR3處理有效磷含量低于CK3處理，并且有達到極顯著差異。對于碳氮比，100 %S的處理中各處理碳氮比無顯著差異(P>0.05)；5 %Ma+95 %S的處理中PC2、AR2相比CK2分別減少了1.53、0.79，差異顯著；5 %Mc+95 %S的處理中PC3、AR3相比CK3分別提高0.41、0.19但差異不顯著(圖3-h)。

圖中白色柱代表不添加蚯蚓處理，灰色柱代表添加P.corethrurus，黑色柱代表添加A.robustus。大寫字母表示同種蚯蚓在不同物料處理下在P<0.05水平下差異顯著性；小寫字母表示同種物料下不同蚯蚓處理在P<0.05水平下差異顯著性

如圖4所示，在主成分載荷圖中(圖4-a)第一主成分(Ax1)和第二主成分(Ax2)的累積方差貢獻率達到74.0 %。其中：第一主成分(Ax1)的方差貢獻率為61.4 %，與有機碳、全氮、全磷、有效磷、碳氮比、碳磷比和氮磷比密切相關(P=0.001)。第二主成分(Ax2)的方差貢獻率為12.6 %，與堿解氮、可溶性有機碳密切相關(P=0.001)。通過主成分得分圖(圖4-b)可以看出同種物料處理條件下，不同種蚯蚓對土壤碳氮磷的影響差異主要體現在第二主成分上，主要在堿解氮和可溶性有機碳上體現差異。而同種蚯蚓在不同物料處理條件下對土壤碳氮磷的影響差異主要表現在第一主成分上，主要在有機碳、全氮、全磷、有效磷、碳氮比、碳磷比和氮磷比上體現差異。

圖4 南美岸蚓和壯偉遠盲蚓對土壤碳氮磷主成分分析Fig.4 Principal component of soil carbon,nitrogen and phosphorus were analyzed by P.corethrurus and A.robustus

圖5中對角線的左下方，給出了2個屬性的散點圖，可以看到第4行第2列的散點圖顯示出有機碳和全氮具有很高的線性相關性。對角線的右上方，數字表示兩個屬性的相關性值，(最大值為1)，星號表示兩者的顯著程度。結果顯示：有機碳、全氮、全磷、有效磷、碳磷比、氮磷比之間呈極顯著正相關關系(P<0.001)；pH與有機碳、可溶性有機碳、全氮、碳氮比呈顯著正相關(P<0.05)與全磷、有效磷、碳磷比、氮磷比呈極顯著正相關關系(P<0.001)。

對角線上顯示的是分布圖；左下部顯示的是具有擬合線的雙變量散點圖；右上部顯示的是相關系數以及顯著性水平，**表示相關性達到P<0.01顯著水平；***表示相關性達到P<0.001極顯著水平

3 討 論

3.1 內層種蚯蚓的生長繁殖特征

本研究中的A.robustus和P.corethrurus是華南地區常見的2種蚯蚓[4，20]。A.robustus主要以土壤顆粒和有機物的混合物為食，一般活動于5～15 cm礦質土層。P.corethrurus廣泛分布在泛熱帶地區，也是中國南嶺以南地區唯一的外來入侵內棲型蚯蚓[14-15]。本研究顯示南美岸蚓和壯偉遠盲蚓的生長繁殖特征的異同之處。首先，添加有機物料都可以促進兩種內棲型蚯蚓生長。從培養第15天開始，在土壤中添加5 %牛糞和蘑菇渣均能顯著提高蚯蚓生物量。這與Barois等研究顯示“與礦質土壤相比，添加有機底物喂養蚯蚓將會有更高的生長”的結果一致[21]。Lowe和Butt綜述他人研究結果也得出內棲型蚯蚓喜歡取食混合有機物料的土壤，特別是有機物料聚集的地方[22]。因此，添加有機物料是飼養內棲型蚯蚓的關鍵。其次，添加有機物料的碳氮磷素化學計量特征影響內棲型蚯蚓的生長。本研究顯示添加牛糞處理對P.corethrurus生長和維持生物量的效果最顯著，而添加蘑菇渣處理對A.robustus生長和維持生物量的效果最顯著。與蘑菇渣相比，牛糞C/N(14.9∶1)和C/P(71.6∶1)相對較低，表明有機物碳氮比和碳磷比的高低、特別是氮素和磷素是南美岸蚓生長的關鍵限制因素[12，23]。而壯偉遠盲蚓能在添加較高碳氮比和碳磷比的蘑菇渣土壤中生存[8]，表明其生長主要受碳素的影響，氮素和磷素對它的限制作用不強。再次，蚯蚓生長特征差異與蚯蚓自身的取食和消化生理特征密不可分[12]。本研究試驗期為90 d，有機物料于試驗初期一次性加入土壤，2種內棲蚯蚓則以相同的生物量但不同數量接種至培養基質。由于與A.robustus相比，P.corethrurus體積小，因此其在盆中的接種數量大，種間競爭激烈。隨著培養時間的增長，P.corethrurus在試驗后期生物量急劇下降。García和Fragoso[12]在用不同植物殘體等有機物(菌類、木屑、可可樹)混合土壤飼養南美岸蚓的實驗中也發現在45 d培養時間后南美岸蚓生物量開始下降。物料中生物可利用養分的缺乏也許是造成這種現象的原因。而A.robustus則在同樣條件下則能正常生長。這也進一步表明P.corethrurus屬于多腐殖質亞型(polyhumic)內棲型蚯蚓，而A.robustus屬中腐殖質亞型(mesohumic)內棲型蚯蚓。對P.corethrurus進行飼養，必須不斷添加高腐殖質有機物料，保持其生長所需；而對于A.robustus飼養，則低腐殖質也可滿足其生長。另外，對于蚯蚓繁殖來講，其受蚯蚓自身品種、接種密度、培養基質種類、形態和養分、環境溫度和濕度等多種原因影響。內棲型蚯蚓與表棲型蚯蚓比較，其本身的繁殖率相對較低[24]，因此目前國內外成功繁殖內棲型蚯蚓的研究十分少[13]。本試驗研究顯示僅有P.corethrurus在培養30 d時5 %牛糞處理的蚯蚓數量有小幅度的增長。P.corethrurus作為華南地區唯一的外侵型蚯蚓，其對環境較強的適應性和抗干擾性是促成外來種大量繁殖變為優勢種的重要原因[25-26]。但是，入侵蚓進入自然環境容易搶奪其他土著蚓的食物和空間，造成本地生物的減少和滅絕，導致生態系統凋落物分解、養分循環和植物生長等一系列變化[27]。因此，對于內棲型蚯蚓的人工繁殖，仍建議采用本地蚓種進行。

3.2 不同種類蚯蚓對添加不同有機物料赤紅壤pH和碳氮磷素轉化的影響

蚯蚓活動能夠顯著影響土壤pH值[4]。本研究結果顯示，接種南美暗蚓和壯偉遠盲蚓均使未添加有機物料處理pH顯著提高了0.31和0.27個單位，接種壯偉遠盲蚓使添加牛糞的土壤pH提高了0.17個單位。前人研究也證實[28]：在酸性旱地土中(pH 4.25)，接種南美岸蚓、壯偉遠盲蚓后，土壤pH值顯著提高0.2～0.8個單位，而且兩者均使土壤趨于中性。南美岸蚓能夠調節土壤酸堿性的原因可能是其具有發達的鈣腺，能夠調節自身對土壤酸度的耐受能力[29]。而對于壯偉遠盲蚓，由于其不具備鈣腺[30]，提升土壤pH可能與皮膚或腸道分泌Ca2+、Mg2+、K+等鹽基離子有關[28]。但是隨著有機物料和蚯蚓同時添加入土壤中，南美岸蚓和壯偉遠盲蚓分別對牛糞和蘑菇渣具有較強的分解能力，大量有機酸物質的產生也許是造成土壤pH的明顯下降的原因。

在土壤形成的過程中，內棲型蚯蚓的存在對有機質的影響顯著。本研究在100 %土壤處理中，南美岸蚓和壯偉環盲蚓活動對土壤有機碳和全氮的影響差異較大。P.corethrurus可以提高未添加有機物料土壤中有機碳和全氮的含量，A.robustus的接種導致了其含量顯著降低。由于在短時間內，內層種蚯蚓選擇性取食土壤顆粒，受腸道消化研磨作用影響，新鮮蚓糞中有機質的分布發生變化，隨之帶來土壤粗顆粒中的有機質顯著下降，而細顆粒中的有機質趨于增加[31]。崔瑩瑩[32]研究證實壯偉遠盲蚓接種后未添加有機物料的土壤中>2000 μm團聚體比例顯著大于南美岸蚓，2000～250 μm團聚體比例前者顯著小于后者。因此，本研究中，與南美岸蚓相比較，壯偉遠盲蚓更喜歡取食粗顆粒土壤，這些土壤顆粒上的有機質優先被消化分解可能是A.robustus接種造成土壤有機質顯著下降的原因。可溶性碳，堿解氮和有效磷是土壤中生物最容易利用的形態。在100 %土壤處理中，P.corethrurus作用提高了土壤堿解氮和有效磷的含量。南美岸蚓通常分泌大量富氮分泌物[24，33]以及某些特殊功能菌促進土壤磷酸酶產生和加速有機磷的礦化可能是導致上述現象的原因[34-35]。

在添加有機物料處理中，土壤全量碳氮磷和有效態養分均顯著增加。但是，當蚯蚓和有機物料同時添加后，各處理土壤碳氮磷的全量和有效態含量變化趨勢不完全一致。全量養分的變化與添加有機物料的碳氮比和碳磷比有顯著相關性。碳氮比和碳磷比相對較高的蘑菇渣和蚯蚓同時接種的處理中，蚯蚓活動顯著促進了碳氮磷在土壤中儲存。這一現象可能與體系中微生物生物量或種群結構的變化有關。通常土壤中細菌的碳氮比為5∶8，真菌的碳氮比為9∶ 15，而細菌的碳磷比通常也比真菌低得多。具有較高碳氮比(25.3∶1)和碳磷比(114.3∶1)的蘑菇渣加入后對體系內真菌的刺激作用會高于細菌。而真菌對底物的長期利用能力和原有碳的保持能力通常高于細菌[36]，碳磷比大時微生物也更容易固定磷[35]，因此蚯蚓作用后蘑菇渣土壤處理中有機碳氮磷處于相對較高的水平。同時，由于南美岸蚓是多腐殖質亞型內棲型蚯蚓，它具有相對較強的有機物料分解轉化能力，因而有機物中較多的碳氮磷進入到到土壤中，造成土壤全量碳氮含量顯著高于接種壯偉遠盲蚓的土壤。對于有效養分，本研究結果顯示隨著外源有機物料和蚯蚓同時加入，土壤可溶性碳、堿解氮和有效磷含量均低于單獨加入有機物料的處理，這可能與處理中蚯蚓和微生物競爭活性碳和有效氮磷養分有關。壯偉遠盲蚓在蘑菇渣處理中活動促使土壤可溶性碳下降量遠低于南美岸蚓處理，在牛糞中促使有效磷含量遠低于南美岸蚓處理，蚯蚓對土壤全量碳氮磷的影響可能是上述變化原因。

4 結 論

C/N為14.9∶1和C/P為71.6∶1的牛糞更適宜南美岸蚓生長繁殖，而C/N為25.3∶1和C/P為114∶1的蘑菇渣更適合壯偉遠盲蚓生長繁殖。單獨接種南美岸蚓能夠促進土壤全量氮和堿解氮、有效磷含量的增加；單獨接種壯偉遠盲蚓則顯著降低土壤有機碳、全氮和可溶性碳含量。接種蚯蚓和添加有機物料聯合作用時，南美岸蚓活動促進蘑菇渣處理中土壤全量氮和有機碳含量的增加，而降低牛糞處理中有機碳、可溶性碳、堿解氮含量；壯偉遠盲蚓則降低牛糞處理中有機碳、全氮、可溶性碳、有效磷含量，蘑菇渣中可溶性碳和有效磷含量。

綜上所述，內棲型蚯蚓活動能夠影響土壤碳氮磷素養分的循環和轉化。鑒于其為食土型蚯蚓，對土壤的物理影響也更為強烈，因此可以考慮將內棲型蚯蚓應用于修復理化質量下降明顯的退化土壤當中。