鑭對銅脅迫下水稻轉錄組模式的調控分析

仲雨晴 陳佳佳

（蘇州科技大學化學生物與材料工程學院，蘇州 215011）

水稻（Oryza sativa）作為重要的糧食作物，其經濟性狀，尤其是對脅迫的耐受性受到密切關注。干旱、重金屬、鹽堿、冷害等非生物逆境脅迫對水稻的生長、發育和結實有嚴重不良影響，是水稻減產的重要因素。由于過量使用含有重金屬的農藥和抗真菌劑等人為活動，耕種土壤和灌溉水中的重金屬污染已成為全球性的農業問題。重金屬對植物的毒性及其隨著食物鏈的積累可能對人體健康造成危害。銅（Cu）是植物必需的微量元素，對植物根系表現出高親和力，參與多種生物過程［1］，但過高濃度的Cu2+會產生毒性，特別是在染色質結構、酶活性、光合作用和呼吸作用等方面［2-3］。因此，提高水稻的Cu2+脅迫耐受性對于保證糧食穩定供應和農業的可持續發展具有重要意義。

稀土元素是一組具有相似物理化學性質的三價金屬元素［4］。稀土在農業上被廣泛用于促進植物種子萌發、生長發育和植物生物量的積累等過程［5］。與其他稀土元素相比，鑭（La）在環境和微肥中含量更高，常被用作稀土微肥的主要成分［6］。多項證據表明，一定濃度的La3+不僅可以保護植物免受環境污染，而且可以促進植物的生長發育。d’Aquino等［7］發現低濃度La3+有助于硬粒小麥種子的發芽和幼苗的生長。La3+可以顯著提高水稻的光合作用，尤其是葉綠體的功能［8］，還可通過與活性氧直接反應改善植物的防御系統來保護大豆免受UV-B輻射誘導的氧化脅迫［9］。這些研究均表明La3+對逆境脅迫下的植物具有良好的保護作用。

隨著高通量測序技術的高速發展，植物中基因表達水平的大規模、高速度鑒定得以實現。目前，在水稻中雖已有關于稀土緩解重金屬脅迫的研究，然而多集中于生理生化水平和單分子水平，且不同研究結果的重復性較低，稀土鑭對于銅脅迫下水稻的生物學功能也尚未明確，然而在轉錄組水平系統地分析La3+對Cu2+脅迫應答中的調控特征更是鮮見報道。本研究采用水培模擬法研究在Cu2+脅迫和不同濃度La3+處理下水稻mRNA的特征表達譜，篩選得到一系列La3+應答mRNA，并對其功能及調控通路深入分析，在轉錄組水平研究La3+對Cu2+脅迫下水稻保護作用的分子調控模式，為水稻的抗逆育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻蘇香粳3號（Oryza sativaL. subsp.Japonicacv. Suxiang 3）來源于江蘇太湖地區農業科學研究所。POD和CAT試劑盒購于南京建成生物工程研究所，Trizol試劑購于上海Sangon生物工程技術有限公司，ribo-zero rRNA試劑盒購于上海歐易生物科技有限公司，DNaseⅠ購于美國碧云天公司，TruSeq Stranded Total RNA試劑盒購于美國Illumina公司，PCR marker購于賽默飛世爾科技公司，AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix熒光試劑購于美國ABI生物技術有限公司，凝膠回收試劑盒購于Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻的培養與處理 粳稻蘇香粳3號種子于36℃催芽1 d露白后轉至光溫培養箱（16 h光照/8 h黑暗，溫度30℃，1∶1∶1∶100霍格蘭營養液）。CuSO4溶液（0、10、20、30、50和100 mg/L）模擬脅迫7 d齡幼苗5 d后取樣測試CuSO4的最佳脅迫濃度。用50 mg/L CuSO4和不同濃度La（NO3）3（0、10、20、30、40和50 mg/L）同時處理7 d齡幼苗5 d后取樣，測試La（NO3）3的最佳處理濃度，每組3個重復。

1.2.2 生理指標測定 參照文獻［10］進行超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性測定，運用過氧化物酶（Peroxidase，POD）試劑盒A084-3和過氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒A007-1測定POD和CAT活性。

1.2.3 RNA提取和RNA-Seq分析 提取總RNA，經DNase I處理后于1%瓊脂糖電泳評估RNA完整性，NanoDrop分光光度計分析RNA純度，使用TruSeq Stranded Total RNA試劑盒創建cDNA文庫，Agilent 2100 Bioanalyzer質檢合格后在Illumina Hiseq 4000平臺進行測序。每個處理3個重復，使用Trimmomatic軟件對原始數據預處理，用htseq-count軟件獲取各樣本中比對到蛋白編碼基因上的序列數，cufflinks軟件計算FPKM值。

1.2.4 差異表達分析和功能注釋 利用DESeq軟件篩選差異表達基因，用負二項分布檢驗進行差異顯著性檢驗，顯著表達基因篩選條件為：P＜ 0.05，差異倍數＞ 2，且FDR＜ 0.05。針對基因本體（Gene ontology，GO）和KEGG數據庫使用DAVID進行基因功能注釋（FDR＜ 0.05）。

1.2.5 qRT-PCR分析 使用Trizol試劑提取總RNA，反 轉 錄 獲 得cDNA后 在AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix熒光試劑中，以cDNA為模板，以水稻肌動蛋白為內參基因，分別擴增目標基因和內參基因。在ABI 7500熒光定量PCR儀上進行擴增，反應條件為95℃ 5 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，40 cycles；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s；40℃ 5 min。采用2-ΔΔCT法計算各基因表達水平。

2 結果

2.1 最適Cu2+脅迫和La3+處理濃度

設置6個濃度梯度CuSO4溶液模擬銅脅迫，分別測定SOD、POD和CAT抗氧化酶活性（圖1）。當Cu2+濃度為0-20 mg/L時，SOD、POD和CAT活性提高，Cu2+濃度升至50 mg/L以上時，脅迫強度的提高加劇膜脂過氧化，抗氧化酶活性顯著下降。因此，選擇50 mg/L Cu2+用于后續脅迫處理。

設置6個濃度梯度La（NO3）3處理經50 mg/L Cu2+脅迫7日齡水稻幼苗，并測定SOD、POD和CAT活性（圖2），有La3+處理樣本的POD和CAT活性均低于單獨Cu2+脅迫組，且在20 mg/L時呈現最大降幅。因此，重金屬防護和緩解效應最適La3+濃度為20 mg/L。

圖1 不同濃度CuSO4對水稻抗氧化酶活性的影響

2.2 La3+誘導差異表達基因的鑒定

利用RNA-Seq檢測20 mg/L La3++50 mg/L Cu2+處理下水稻葉片mRNA表達譜，50 mg/L Cu2+處理組水稻葉片作為對照。使用Illumina HiSeq 4000平臺共獲得5.764億原始讀取，去除低質量和銜接子序列，共有564.11百萬個原始序列（81.28 Gb），各樣品有效數據量分布在12.67-14.00 G之間，Q30堿基分布在93.94%-95.15%，平均GC含量46.18%。差異表達分析共鑒定獲得7 020個差異表達基因（圖3），其中3 222個（45.90%）上調，3 798個（54.10%）下調。對差異表達基因進行非監督層次聚類分析，結果如圖4所示，對照組和La3+處理組的樣品各自聚為一簇，驗證了同組樣本間相關性，聚在同一個簇中的基因可能具有相似的生物學功能，在La3+誘導的Cu2+脅迫應答中起重要作用。

圖2 不同濃度La（NO3）3對水稻葉片抗氧化酶活性的影響

圖3 La3+處理的水稻葉片中差異表達基因的MA圖

2.3 La3+誘導差異基因的功能和通路富集分析

圖4 La3+處理下水稻差異表達基因聚類圖

為進一步挖掘La3+誘導的差異基因的生物學功能，對其進行了GO富集和KEGG通路分析。采用超幾何分布檢驗篩選FDR ＜ 0.05的顯著富集GO條目和KEGG通路。分別統計La3+誘導差異基因顯著富集的前5條生物學過程、細胞組分和分子功能（圖5）。KEGG通路富集結果表明，與單一Cu2+脅迫相比，La3+處理可特異性改變112條信號轉導通路，共涉及5 661個差異表達基因。其中富集最顯著的3條通路為苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代謝和植物激素信號轉導，分別對應47、46和71個差異表達基因。表1列出了La3+處理下按P值排序排名前10的KEGG通路。

2.4 差異mRNA的表達驗證

為驗證測序結果，采用Trizol法提取水稻葉片總RNA（圖6-A）。選擇4個基因（CHIT13、Laccase、Expansin和GH3.4）進行qRT-PCR（圖6-B），所設計引物均擴增獲得清晰產物條帶。由表2可見，CHIT13、Laccase和GH3.4呈 明 顯 上 調 趨 勢，而Expansin表達水平顯著下調。分別統計La3+處理前后各基因相對表達量（圖6-C），發現測序和qRTPCR所有轉錄本的表達趨勢均一致，表明測序結果的可靠性。

表1 La3+處理下顯著富集的KEGG通路

3 討論

圖5 水稻中差異表達基因的基因本體（GO）富集分析

表2 qRT-PCR驗證差異表達基因

稀土元素對重金屬脅迫的緩解作用已被廣泛報道。在小麥、黃瓜等植物中已有關于稀土鑭緩解鎘脅迫的研究［11］；鑭還可通過調節AsA和GSH代謝減輕鎘誘導的氧化損傷，從而提高玉米對鎘的耐受性［12］。雖然稀土提高植物重金屬耐受性的機制研究已取得一定進展，然而目前多局限于生理生化和單分子水平。隨著高通量測序技術的快速發展，迫切需要在全轉錄組水平系統地探究稀土元素在植物非生物脅迫應答中的作用機制。目前，尚無關于稀土La3+誘導下水稻全基因組表達譜的研究報道，La3+調節水稻重金屬耐受性的確切生物功能和調控通路并不清楚。

水稻面臨Cu2+脅迫時，抗氧化機制被激活，SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性提高，以降低活性氧基團（ROS）對膜系統的傷害。低濃度的La3+處理可增強ROS清除系統的能力并抑制自由基形成，從而緩解Cu2+脅迫產生的應激損傷，而高濃度的La3+比Cu2+更強烈地誘導ROS，高水平的ROS超出抗氧化劑系統的處理能力，無法及時從水稻細胞中排出，從而不斷積累引起細胞膜損傷，反而引起酶活上升。

圖6 測序結果的qRT-PCR驗證

對Cu2+脅迫和La3+處理下的水稻轉錄組進行RNA-Seq測序共鑒定獲得7 020個La3+應答mRNA。qRT-PCR方法驗證了測序結果的可靠性，CHIT13、Laccase和GH3.4明顯上調，而Expansin明顯下調。此前報道的水稻重金屬脅迫應答基因多為重金屬螯合或轉運相關的功能基因。本研究通過功能注釋發現，La3+調控水稻抵御Cu2+脅迫過程中的關鍵基因多富集于細胞壁中。通過qRT-PCR驗證的4個La3+應答基因均與植物細胞壁有關。細胞壁是植物暴露于重金屬的第一個結構，為植物提供了保護作用和豐富的可再生物質。大多數元素如Zn2+、Cd2+、Fe2+、Mn2+和Cu2+都以二價離子的形式進入植物。因此，細胞壁可以通過改變化學組成來減少重金屬的吸收。CHIT13編碼的幾丁質酶是植物防御系統中重要的酶，能水解幾丁質并釋放寡聚體，引發一系列植物防御反應［13］。過表達幾丁質酶基因的花生對黃曲霉、晚葉斑病和銹病具有更好的抗性［14］，相同結果在番茄中也得到驗證。本轉錄組分析表明，La3+處理強烈誘導幾丁質酶基因表達，通過調節細胞壁的組成，緩解Cu2+對水稻產生的損害。

Laccase編碼的漆酶催化生成的高級木質素參與植物發育和脅迫響應［15］。已知短柄草木質化組織中至少存在兩種漆酶參與木質素在細胞壁上沉積的過程［16］。本研究La3+處理大大增強了漆酶前體活性，漆酶分泌到植物細胞次生壁中，催化木質素單體氧化聚合，有助于提高水稻對Cu2+脅迫的抗逆性。

此外，La3+處理后GH3.4編碼的吲哚乙酸-酰胺合成酶上調，同時Expansin編碼的擴張蛋白表達水平降低，根據這種負相關表達模式推測GH3.4在擴張蛋白Expansin表達中起負向調節作用。水稻GH3家族成員可編碼吲哚乙酸-酰胺合成酶，該酶在脅迫下顯著上調［17］，可催化植物激素吲哚乙酸（IAA）的酰胺化。擴張蛋白為植物細胞壁糖蛋白，可誘導細胞壁伸展使之疏松，在植物生長、發育和抗逆性中發揮重要作用［18］，而其表達取決于IAA水平。據此推測GH3.4可通過催化IAA的酰胺化，抑制由IAA誘導的擴張蛋白表達，從而緩解植物細胞壁的疏松狀態，并抑制細胞攝取過量Cu2+引起的損傷，從而提高水稻對重金屬脅迫的抗性（圖7）。

圖7 La3+誘導的細胞壁防御分子機制

GO注釋發現La3+應答基因顯著富集于95個生物過程、細胞組分及分子功能，其中富集最顯著的有脂質代謝、細胞壁和質膜等，這與干旱脅迫下云南割手密轉錄組結果一致［19］。KEGG通路富集結果表明5 661個差異基因富集在氨基酸代謝以及植物激素信號轉導等通路，這與低溫脅迫下水稻的通路富集結果相似，同時印證了水稻在受到非生物脅迫時，調控代謝和形態的差異基因開始大量表達［20］。

在差異基因顯著富集的植物激素信號轉導通路（Osa04075）中，共有71個基因在La3+處理后差異表達，其中29個表達上調，42個表達下調，覆蓋了色氨酸代謝、玉米素生物合成、二萜類生物合成、類胡蘿卜素生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、油菜素生物合成、α-亞麻酸代謝和苯丙氨酸代謝等8個激素信號轉導相關模塊。其中色氨酸代謝模塊涉及的多個生長素合成途徑相關基因在La3+處理后表達均下調。例如，La3+處理能抑制生長素轉運蛋白（AUX1）和其下游生長素響應蛋白（TIR1）的表達，引起由泛素介導的生長素活性誘導基因蛋白（AUX/IAA）水解并釋放出轉錄因子ARF。ARF介導生長素反應蛋白（SAUR）和GH3家族成員表達下調，從而負向調節水稻細胞擴展生長，減少重金屬離子的吸收。在苯丙氨酸代謝模塊中，與水楊酸合成相關的調節蛋白NPR1正向調控轉錄因子TGA和PR1表達上調，從而增加了水稻的抗逆性。上述基因的差異表達從通路層面為本研究提出的La3+誘導的重金屬防御模型提供了理論支持。

4 結論

一定濃度范圍內的La3+能顯著提高水稻對Cu2+脅迫的耐受性，鑒定了一系列La3+響應性mRNA和相關代謝通路，提出了La3+誘導的細胞壁防御新機制。