固相萃取-高效液相色譜法測定碳酸飲料中7種合成著色劑

張 敏

上海工微所科技有限公司，上海 200233

著色劑是使食品著色和改善食品色澤的物質，通常包括食用合成色素和食用天然色素兩大類等[1]。食品本身的色澤在被加工、貯存以及運輸過程中，因受到了外界因素(如光照、加熱、酸堿腐蝕等)的影響，自身原來的顏色就會發生褪變，進而影響到食品的外部感觀和性狀[2]。天然色素在加工保存過程中容易褪色和變色，成本又高，相比之下，合成色素色彩鮮艷，著色力好，價格便宜，所以合成色素已在食品中被廣泛應用[3]。但是，違規使用合成色素會危害人體健康，導致生育力下降，引發兒童行為過激，損傷智力發育，有些色素在人體內可能轉換成致癌物質，特別是偶氮化合物類合成色素的致癌作用更明顯[4]。為了避免濫用合成著色劑，我國GB2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[5]對允許使用的合成著色劑的種類、適用范圍和最大使用限量都作出了明確的規定。目前，合成著色劑的主要檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法、毛細管電泳法、薄層色譜法、示波極譜法等[6]。

GB5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》規定了食品中檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍和赤蘚紅這7種合成著色劑的高效液相色譜測定方法[7]。該國標方法的前處理需要經過吸附-解析或液-液萃取過程，步驟繁瑣，易造成目標物的損失，導致結果不準確，回收率偏低等問題。本實驗針對碳酸飲料樣品在此方法的基礎上進行了改進優化，操作快速簡便，結果準確可靠。最終得出較高效的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：市售碳酸飲料

試劑：檸檬黃1 000 μg/mL標準品，新紅1 000 μg/mL標準品，莧菜紅1 000 μg/mL標準品，胭脂紅1 000 μg/mL標準品，日落黃1 000 μg/mL標準品，亮藍1 000 μg/mL標準品，赤蘚紅1 000 μg/mL標準品(北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司)；氨水(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)；甲醇(色譜純，DIKMA)；乙酸銨(色譜純，MACKLIN)。

1.2 儀器與設備

Thermo Scientific U3000高效液相色譜儀(WPS-3000SL 自動進樣器，DAD-3000二極管陣列檢測器，ChromeleonTM7色譜工作站)；METTLER TOLEDO電子天平MS204TS/02；數顯恒溫水浴鍋HH-4(國華電器有限公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；固相萃取儀；固相萃取小柱CNW poly-sery PWAX SPE Cartridge 150 mg，6 mL；氮吹儀PRESSURE GAS BLOWING CONCENTRATOR DC12H。

1.3 實驗方法

1.3.1標準曲線的配制

準確吸取200 μL檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍、赤蘚紅標準品于10 mL容量瓶中，加水溶解配置成20.0 μg/mL的標準儲備溶液，再逐級稀釋得到的0.50 μg/mL，1.00 μg/mL，2.00 μg/mL，5.00 μg/mL，10.00 μg/mL的標準工作溶液。

1.3.2色譜條件

色譜條件：色譜柱SunShell C18(5 μm，4.6 i.d.*250 mm)；保護柱SunShell Guard Cartridge Column RP；柱溫30 ℃。

流動相：A為甲醇，B為0.02 mol/L的乙酸銨溶液；流速為1.0 mL/min；測定波長為254 nm，529 nm，630 nm；進樣量：10 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.3樣品前處理

稱取1.0 g(精確至0.000 1 g)樣品于玻璃試管中，超聲10 min，待凈化。poly-sery PWAX小柱使用前依次用5 mL甲醇，5 mL水活化。將全部待凈化液全部上樣至小柱，棄去流出液。依次用5 mL甲醇，5 mL水淋洗小柱，并吹干。最后用6 mL氨水-甲醇(10+90)洗脫，收集洗脫液。洗脫液于50 ℃水浴下氮氣吹至余0.3 mL，用初始流動相定容至1.0 mL，渦旋均勻后，過0.45 μm水相濾膜上機。

2 結果與討論

2.1 液相色譜圖

通過對液相條件優化，選擇最佳液相色譜條件。其中亮藍為非偶氮類酸性染料，主要有3個同分異構體，為3個同分異構體的混合物，一般大致組成為間位磺化物∶對位磺化物∶鄰位磺化物=(75～85)∶(15～20)∶(0～8)[8]。故將三個峰視為整體考慮。7種合成著色劑標準品液相色譜圖如圖1所示。

1-檸檬黃；2-新紅；3-莧菜紅；4-胭脂紅；5-日落黃；6-亮藍；7-赤蘚紅圖1 7種合成著色劑液相色譜圖

2.2 線性范圍和檢出限

采用外標校準曲線法測定7種合成著色劑標準溶液的含量，以標準工作溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。將標準工作溶液逐級稀釋，以信噪比S/N=3考察了7種合成著色劑的檢出限。在0.50 μg/mL～10.00 μg/mL范圍內線性良好，滿足檢測需求。結果見表2。

表2 7種著色劑線性方程、保留時間、相關系數、測定波長及檢出限

2.3 前處理條件優化

2.3.1樣品pH調整

poly-sery PWAX固相萃取柱是混合型弱陰離子交換小柱，對強酸性化合物有很好的選擇性。所選樣品成分中含有檸檬酸、二氧化碳等，pH在3左右，提供了酸性環境。故未對樣品pH進行調整，但若選取的樣品是非酸性環境下，建議加入適量甲酸調整pH。

2.3.2淋洗液選擇

在固相萃取淋洗過程中，分別考察對比了5 mL甲醇甲酸(6+4)+5 mL水(A)、5 mL水(B)、5 mL甲醇+5 mL水(C)三種淋洗液對結果的影響。7種合成著色劑在三種淋洗體系中回收率如表3所示。

表3 7種合成著色劑在三種淋洗體系中回收率

結果發現：除赤蘚紅外其余6種合成著色劑在三種淋洗體系中回收率為A>C>B。A淋洗體系回收率略高于C淋洗體系，C淋洗體系回收率比B淋洗體系高5%～9%。赤蘚紅在A淋洗體系中回收率遠低于B、C淋洗體系?？赡苡捎诔嗵\紅本身耐酸性差，在甲醇甲酸(6+4)淋洗過程中提前被洗脫。

2.3.3復溶液選擇

在水浴氮吹及復溶過程中，分別考察了吹干樣液+1 mL水復溶(A)、吹干樣液+1 mL初始流動相復溶(B)、余0.3 mL樣液+1 mL水復溶(C)、余0.3 mL樣液+1 mL初始流動相復溶(D)四種操作對結果的影響。7種合成著色劑在四種條件下回收率如圖2所示。

圖2 7種合成著色劑在四種操作下回收率

結果發現：7種合成著色劑在四種條件下回收率D>C>B>A。樣液在吹干后，色素易附著在玻璃管壁上，復溶時無法完全溶解，容易造成損失。在選擇復溶液時，水和初始流動相皆可，但比較之下，初始流動相對于回收率有更大的正相作用。

2.4 回收率和重復性

選擇某品牌碳酸飲料進行3個不同添加水平加標實驗。加標水平分別為：1 mg/kg、4 mg/kg和8mg/kg，每個加標水平重復六次。結果如表4所示。結果表明，方法回收率在84.8%～96.1%，相對標準偏差在0.81%～2.50%，滿足實驗要求。

2.5 與聚酰胺吸附法、液-液分配法的比較

根據GB5009.35—2016《食品安全國家標準 食品中合成著色劑的測定》，采用聚酰胺吸附法、液-液分配法對加標樣品進行回收率測定。

聚酰胺吸附法：稱取5.0 g(精確至0.000 1 g)樣品于100 mL燒杯中，超聲除二氧化碳。樣品溶液加熱到60 ℃，將1 g聚酰胺粉加少許水調成粥狀，倒入樣品溶液中，攪拌，以G3垂融漏斗抽濾，用60 ℃ PH=4的水洗滌三次，用甲醇-甲酸溶液(6+4)洗滌三次，再用水洗滌至中性，用10 mL乙醇-2%氨水-水混合溶液(7+2+1)解吸5次，直至完全解吸，收集解吸液，加乙酸中和，蒸發至近干，加水溶解，定容至5 mL。經0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣。

表4 7種著色劑的回收率結果(n=6)

液-液分配法：稱取5.0 g(精確至0.000 1 g)樣品于100 mL燒杯中，超聲除二氧化碳。將樣品溶液倒入分液漏斗，加2 mL鹽酸、10 mL三正辛胺-正丁醇(5%)溶液，振搖提取，分取有機相，重復提取三次，合并有機相，用飽和硫酸鈉溶液洗2次，每次10 mL，分取有機相，放蒸發皿中水浴加熱至10 mL，轉移至分液漏斗中，加10 mL正己烷，混勻，加5 mL 2%氨水溶液提取，重復三次，合并氨水溶液層，用10 mL正己烷洗2次，氨水溶液層加乙酸中和，蒸發至近干，加水溶解，定容至5 mL。經0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣。

7種合成著色劑在三種測定方法下回收率如圖3所示。

圖3 7種合成著色劑在三種測定方法下回收率

結果發現：7種合成著色劑在三種測定方法下回收率為固相萃取法>聚酰胺吸附法>液-液分配法。其中赤蘚紅采用聚酰胺吸附法時回收率遠低于其他兩種方法，因為其余6種合成著色劑能和聚酰胺間形成氫鍵而被牢牢吸附，但赤蘚紅只有羧基，氫鍵作用弱，被聚酰胺粉吸附后，會被甲醇-甲酸洗脫，故GB5009.35—2016采用液-液分配法。但聚酰胺吸附法和液-液分配法都步驟繁瑣，耗時多，所需試劑較多，在操作過程中易損失，總體不如固相萃取法。

3 結論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜法測定碳酸飲料中7種合成著色劑的測定方法。該方法前處理簡單快捷，有效減少樣品基質對目標物的干擾，各目標化合物在各自濃度范圍內線性良好，加標回收率和相對標準偏差均能符合要求?？捎糜谔妓犸嬃现腥藶樘砑雍铣芍珓┑臋z測，對其質量安全進行有效控制。