雙歧桿菌的分離培養和生理功能研究進展

楊 淼， 趙笑笑， 宋 馨， 夏永軍， 艾連中， 熊智強

上海理工大學醫療器械與食品學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海 00093

腸道微生物菌群種類和數量繁多，主要包括厭氧菌和兼性厭氧菌。正常情況下腸道菌群維持在平衡狀態，但飲食結構失衡、抗生素濫用、生活作息不規律和腸道感染等因素會造成腸道菌群失調，導致腹瀉、便秘、色斑、內分泌失調和免疫力下降等代謝疾病[1]。雙歧桿菌是腸道健康指示菌，其豐度受年齡、健康狀況和精神壓力等因素影響[2]。在健康嬰兒腸道內雙歧桿菌豐度占腸道微生物90%以上，隨著年齡的增加，人體內雙歧桿菌的種類和豐度逐步下降，老年人體內的雙歧桿菌豐度很低。但國內外長壽老人的雙歧桿菌含量與年輕人差異不大，這可能是其長壽的重要原因。雙歧桿菌具有促進腸道健康、延緩衰老、提高人體免疫、降血糖、降血脂和降膽固醇等生理活性[3,4]。本文介紹雙歧桿菌的特征分類、分離方法和生理活性功能，以期對雙歧桿菌的開發應用提供幫助。

1 雙歧桿菌的特征和分類

雙歧桿菌是革蘭氏陽性菌，屬于細菌域、放線菌門、放線菌綱、雙歧桿菌目、雙歧桿菌科。雙歧桿菌已發現7個屬、32個種，廣泛分布存在于腸道、糞便、口腔和乳汁等環境中(表1)。雙歧桿菌生理特性包括過氧化氫酶陰性、氧敏感、GC含量高、生長條件嚴格、最適生長溫度在37 ℃～41 ℃、最適生長pH在6.5～7.0[5]。形態上多為乳白色或微黃色的球形、扁平形或尖錐形，末端分叉呈V形、Y形或長條彎曲狀，Ca2+、N-乙酰氨基葡萄糖和部分氨基酸會影響其細胞形態。代謝特征包括在人體內能合成多種維生素，發酵方式為異型乳酸發酵，能產生醋酸、乳酸和丙酸等多種短鏈脂肪酸，能水解乳糖、葡萄糖、甘露糖和低聚果糖等寡糖，具有特殊的“雙歧”或“Bifido shunt”糖代謝途徑。由于雙歧桿菌通過果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶(F6PPK)水解葡萄糖，因此F6PPK作為標志性酶用于雙歧桿菌的分類和鑒定。

2 雙歧桿菌的分離培養

MRS(De Man,Rogosa,Sharpe)、哥倫比亞(Columbia)、WC(Wilkins-Chalgren)和TPY(Tryptone-peptone-yeast)瓊脂培養基是目前分離雙歧桿菌常用的基礎培養基。在此基礎上改良的BSM(Bifidobacteriumselective medium)、BFM(Bifidobacteriummedium)、RB(RaffinoseBifidobacterium)、MTPY(Modified TPY)和RP-MUP(Raffinose-Propionate Lithium Mupirocin)等培養基具有更高的分離效率[1]，但存在成分復雜、價格昂貴、滅菌和冷卻溫度嚴格以及需要調整pH等缺點[2]。FERRARIS等[7]優化出WCB(Wilkins-Chalgren forBifidobacterium)和WCBM(Wilkins-Chalgren forBifidobacteriumMupirocin)選擇性培養基，既易制備，又具有良好的篩選效果，與樣品通過16S rRNA定量的雙歧桿菌種類相近，可作為分離雙歧桿菌的首選培養基。在此基礎上，采用表2策略可進一步提升雙歧桿菌的分離效率。

表1 雙歧桿菌的來源和分類[6]

策略1：添加顯色劑。顯色劑用于辨別菌落，在一定程度上提高培養基的選擇性。例如CHEVALIER等[8]在培養基中加入X-α-Gal作為顯色劑，由于雙歧桿菌屬具有較強的α-半乳糖苷酶活性，能水解X-α-Gal釋放吲哚，使菌落呈現藍色，可以快速的區分雙歧桿菌與乳酸桿菌和乳酸鏈球菌。另外，溴甲酚紫[9]作為酸堿指示劑可添加在培養基中。若菌落產酸，周圍則產生黃色圈，可區分雙歧桿菌和不產酸細菌。但添加顯色方法也存在局限性，部分其它種類乳酸菌不但有很強的產酸能力，也具有很高的半乳糖苷酶活性，通過顯色不能區分雙歧桿菌和這些乳酸菌。

策略2：添加抗生素。萬古霉素、四環素、青霉素、林肯霉素、紅霉素、氯霉素和桿菌肽對雙歧桿菌有較強的殺傷力，而雙歧桿菌對新霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素等氨基糖苷類抗生素和多粘菌素普遍不敏感[10]，因此，添加這類不敏感的抗生素，可提高雙歧桿菌分離培養基的選擇性。雖然伯杰氏系統細菌學手冊表明添加莫匹羅星能夠滿足雙歧桿菌的分離，但梭狀芽胞桿菌[11]等許多厭氧菌具有莫匹羅星抗性。因此， VLKOVA等[12]聯合添加諾佛沙星(200 mg/L)、莫匹羅星(100 mg/L)和冰醋酸(1 mL/L)的培養基能夠抑制梭狀芽胞桿菌生長，但對雙歧桿菌生長沒有影響。對于糞便等復雜環境樣品，由于微生物數量多、種類復雜，要分離雙歧桿菌的同時，抑制類桿菌屬、梭菌屬、球菌屬等細菌和真菌，在培養基中添加復合抗生素是一個很好的選擇。但從乳制品等簡單樣品中分離雙歧桿菌，國際乳品聯盟建議添加50 mg/L莫匹羅星用于抑制其他乳酸菌的生長。

表2 雙歧桿菌的分離培養基

策略3：添加促雙歧桿菌生長因子。雙歧桿菌生長條件苛刻，營養物質應盡可能豐富，可添加小分子肽和低聚糖等益生元顯著促進雙歧桿菌的生長。在MRS培養基中，添加馬血清、Fe2+、維生素K和精氨酸等營養物質提高雙歧桿菌生長速度，還可以添加L-半胱氨酸鹽酸鹽、維生素C和丙酮酸鈉等還原劑制造厭氧環境，有利于雙歧桿菌的生長。在哥倫比亞培養基中添加棉子糖作為選擇性碳源[13]，并且加入氯化鋰和丙酸鈉抑制腐敗菌的生長，或冰醋酸和莫匹羅星聯用，通過降低培養基pH以抑制其他細菌的生長。

3 雙歧桿菌功能活性

腸道是食物消化吸收的場所，為人體各項生命活動提供所需的原料。腸道內雙歧桿菌的豐度直接影響人體健康狀況，研究表明雙歧桿菌能促進腸道健康、調節“三高”、延緩衰老和提高機體免疫力等多種生理功能(表3)。

表3 雙歧桿菌的生理功能

3.1 促進腸道健康

當人體處于亞健康狀態和腸動力不足時，腸道內有益菌豐度下降，而腐敗菌和致病菌大量繁殖并分泌各種毒素，使腸黏膜屏障受損，最終導致機體免疫力下降。機體腸道菌群紊亂，極易出現腹瀉、便秘和其他腸道疾病。補充雙歧桿菌能顯著改善腸道微生態失衡、治療腹瀉、降低腸內毒素水平和改善腸道黏膜屏障功能[18]。雙歧桿菌可產生多種不飽和脂肪酸，降低腸道pH及產生細菌素“Bifidin”[19]和過氧化氫，抑制或殺死腐敗菌和致病菌，并通過糖蛋白和脂磷壁酸等大分子與腸黏膜細胞表面的特異受體結合，占領腐敗菌和致病菌的定植位點，與其形成生物拮抗，為機體內有益菌定植提供條件。

3.2 降膽固醇

目前雙歧桿菌降解膽固醇機制有共沉淀[22]和同化[23]兩種理論。在分子水平上，雙歧桿菌能影響膽固醇代謝中關鍵基因和酶系的表達。SALEHI-ABARGOUEI A等[29]認為雙歧桿菌活細胞降解膽固醇是通過同化和共沉淀共同作用，而死細胞只通過共沉淀作用。當pH升高時，膽固醇會從共沉淀中完全釋放。ZANOTTI等[25]研究了17種雙歧桿菌菌株的膽固醇降低能力，證明模式菌株長雙歧桿菌PRL2010提高了負責轉運膽固醇的蛋白和還原酶的表達水平。雙歧桿菌的降膽固醇機制還與膽固醇合成分解代謝中多種酶系的活性直接相關，其中β-羥基-β-甲基-戊二酸單酰輔酶A(HMGCoA還原酶)和7α-膽固醇羥化酶(CYP7A1)是關鍵酶，膽固醇水平的高低可以用這兩種酶的活性作為參考[26,27]。

3.3 控制血糖

糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，由胰島素分泌缺陷及其生物作用受損，導致眼、腎、心臟和血管等多種組織和器官的慢性損害和功能障礙。研究表明糖尿病患者體內的雙歧桿菌數量明顯減少[44]，且與高密度脂蛋白膽固醇呈正相關。當雙歧桿菌數量恢復正常時，體內炎癥因子也相應減少[45]。對I型糖尿病小鼠灌胃青春雙歧桿菌后，發現小鼠胰島細胞的超微結構得到保護，γ干擾素的水平降低，實驗表明雙歧桿菌能預防和延緩I型糖尿病癥狀。雙歧桿菌對II型糖尿病大鼠胰島細胞也有同樣的保護作用[30,31]。二肽基肽酶4抑制劑(DPP-4抑制劑)是目前糖尿病治療的常見藥物。雙歧桿菌IF3-211和雙歧桿菌IF1-11也具有DPP-4類似的抑制性能[46]，能夠抑制胰高血糖素和促進胰島素的分泌。α-葡萄糖苷酶是水解碳水化合物、生成葡萄糖的關鍵酶, RAMCHANDRAN等[32]發現雙歧桿菌能抑制其活性來防止血糖的升高。

4 問題與展望

盡管雙歧桿菌的分離、篩選和鑒定技術方法成熟，但樣品來源比較單一，多為糞便和乳制品，可盡量擴大樣品的種類來源和地域范圍，提高雙歧桿菌多樣性。利用宏基因組和單細胞測序等技術，加強對難培養或目前不可培養的雙歧桿菌研究，解決其難培養或不可培養的機制，提升我們對雙歧桿菌的認識。眾多研究表明雙歧桿菌具有促進腸道健康、調節“三高”和提高免疫力等生理功能，但研究熱點多集中在雙歧桿菌細胞壁、腸病治療和細胞因子等方面，多數以小鼠模型展開研究，其結果與臨床應用尚有較大的差距。關于雙歧桿菌和人體細胞、癌細胞、或病原菌具體作用機制的研究較少，特別是不同生理功能之間是否存在網絡互作還需進一步探索。隨著我們加深對雙歧桿菌生理功能和作用機制的研究，必將推動雙歧桿菌的資源利用和產業開發。