牡丹廢棄物用于制備發酵可利用還原糖的研究

王軍華，張翔，王易芬，張彥昊，辛雪，陳蕾蕾，趙雙枝

（山東省農業科學院農產品研究所／山東省農產品精深加工技術重點實驗室／農業農村部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100）

牡丹是我國特有的木本花卉和藥用植物，自2011年中國政府批準牡丹籽油作為一種新的食品資源以來，每年都有大量的牡丹籽被采集作為生產油脂的原料［1，2］。但在采收牡丹種子的同時，往往會有枝、葉、果莢等摻雜其中，通常在晾曬后再進行分離去除，因此牡丹籽油生產中會產生大量的廢棄物，這些廢棄物或者被作為低值柴薪，或者被大量丟棄影響生態環境［3，4］。

目前關于牡丹廢棄物的研究較少，主要集中于牡丹果莢中有效成分的提取，如抗氧化活性物質［5］、白藜蘆醇［6］、黃酮類化合物［1］以及多糖［3，4］等，而對其中豐富的纖維素鮮少關注。前期研究發現，牡丹的葉、果莢、枝中纖維素、半纖維素和木質素含量在44%～72%之間，含量較高［7］。有研究證明，一些木質素、纖維素、半纖維素含量高的生物材料如雜交楊木、柳枝稷、玉米淀粉、餐廚垃圾等，可經處理后制備發酵可利用還原糖，再經生物轉化制備高附加值產品，如生物燃料、可降解生物塑料等［8-10］。因此，本研究對牡丹籽油生產中廢棄物的木質纖維素組成和制備發酵可利用還原糖的方法和產量進行研究，以期開拓牡丹廢棄物的新功能，開辟新的應用途徑，同時解決其棄置帶來的環境污染和資源浪費問題，從而完善牡丹產業鏈條，為促進牡丹產業的發展起到積極作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

牡丹（Paeonia ostii）枝、果莢、葉均采自山東菏澤牡丹示范基地，晾干后分開收集，經微型植物試樣粉碎機（FZ102，北京市永光明醫療儀器廠）粉碎后過60～80目篩，自封袋分別分裝，陰涼干燥處保存。纖維素酶（Aspergillus niger，1.4 U／mg），購于Sigma-Aldrich；其他化學試劑為市售分析純試劑。

1.2 牡丹廢棄物中木質纖維素組分分析

1.2.1 木質纖維素含量分析 將粉碎后的牡丹枝、果莢、葉樣品，在（105±2）℃下干燥至恒重后測定其木質纖維素含量。酸性洗滌纖維（ADF）測定參照NYT 1459—2007；中性洗滌纖維（NDF）測定參照GB／T 20806—2006；酸性洗滌木質素（ADL）測定參照GB／T 20805—2006。

根據以下公式計算樣品中的木質纖維素含量［11］：

半纖維素（%）＝NDF（%）-ADF（%） ；纖維素＝ADF（%）-經72%硫酸處理后的殘渣（%） ；

ADL（%）＝經72%硫酸處理后的殘渣（%）-灰化后的灰分（硅酸鹽，%） 。

1.2.2 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜分析 取0.1 g樣品，經KBr壓片，使用Bruker vertex 70（德國布魯克公司）近紅外光譜分析儀，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，每個樣品掃描32次。

1.3 牡丹廢棄物預處理及其效果分析

1.3.1 原材料的預處理 設置微波-堿法和水浴-堿法兩種方法對原材料進行預處理，以篩選還原糖產量高的預處理方法。取3.0 g樣品，加入2%（m／v）的NaOH溶液30 mL，室溫放置溶脹1 h，然后分別采用微波和水浴加熱處理1 h：①以896 MHz、20 kW 的微波源進行加熱預處理（由上海海洋大學食品學院食品熱加工工程技術研究中心提供設備和技術支持），溫度（90±3）℃；②水浴加熱，溫度（90±1）℃。

預處理結束后用布氏漏斗趁熱過濾，上清液留待GC-MS分析；濾渣用熱水清洗至中性，通風干燥至少72 h，再粉碎過60～80目篩使樣品均勻，以備FTIR分析和還原糖制備。

1.3.2 原材料預處理效果的GC-MS和FTIR分析 （1）氣相色譜-質譜（GC-MS）分析：利用7890氣相色譜儀串聯5977四級桿質譜儀（美國Agilent公司），選用HP-5MS彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）對預處理樣品的上清液進行成分分析。初始溫度40℃，保持4 min，然后以3℃／min的速度上升至250℃，保持20 min；進樣口250℃，分流比30∶1；載氣（He）流速1.0 mL／min。電子電離源，轟擊能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，全掃描模式，m／z 35～350。

（2）FTIR分析：取0.1 g預處理后的樣品，參考1.2.2所述方法進行FTIR分析。

1.3.3 還原糖制備及含量測定 采用纖維素酶解法制備還原糖：稱取0.2 g預處理后的樣品，加入10 mL檸檬酸鈉緩沖溶液（50 mmol／L，pH 4.8），加入200 U纖維素酶，使酶的終濃度達到1 000 U／g，在50℃、180 r／min條件下酶解36 h。反應結束后，沸水浴10 min滅活纖維素酶，10 000 r／min離心2 min，取上清用于還原糖含量測定。

參考文獻［12］的方法，以葡萄糖為對照，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖含量。標準曲線繪制：配制5.20 mg／mL的葡萄糖標準溶液，分別吸取0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μL的標準溶液于5 mL離心管中，分別加入100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、0μL雙蒸水，然后加入150μL DNS試劑，煮沸5 min，冷卻后加1 750μL雙蒸水至總體積2 mL，測定540 nm處吸光度值OD540。以不加葡萄糖的處理組為空白對照，扣除本底，以葡萄糖濃度（mg／mL）為橫坐標、OD540為縱坐標制作標準曲線。

取酶解反應后的上清液，稀釋至適當濃度，加入150μL DNS試劑，按照上述方法測定OD540，扣除本底，根據標準曲線計算出酶解后的還原糖濃度CR。

CR＝C0×n，其中C0為根據標準曲線得出的還原糖濃度，n為稀釋倍數。

1.4 數據處理

數據利用Microsoft Excel 2010軟件進行統計，利用SPSS 22.0軟件采用Duncan’s法進行0.05水平的顯著性分析。方差分析結果均以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 牡丹不同部位廢棄物中木質纖維素組成分析

牡丹枝中的木質纖維素（木質素、半纖維素、纖維素）含量最高，達72.84%，葉和果莢中的含量相當；枝中的綜纖維素（半纖維素、纖維素）含量最高（56.09%），遠高于葉（36.19%）和果莢（40.00%）（表1）。

表1 牡丹不同部位廢棄物中的木質纖維素組成 （%）

對木質材料的近紅外光譜研究顯示，所有木材樣本均會出現以下吸收峰：在3 400 cm-1附近和2 900 cm-1附近出現顯著的峰型，在1 750～1 000 cm-1的廣泛吸收范圍內涵蓋許多離散峰［13］。本研究對牡丹葉、果莢、枝三個部位的FTIR分析結果也顯示，在上述相應位置同樣出現這些主要特征峰，僅有部分收縮振動峰的位置和峰型存在差異（表2）。

在1 512～1 515 cm-1和1 238～1 245 cm-1的峰位是表征木質素的主要吸收峰，其中，1 238～1 245 cm-1附近的峰是表征木質素中愈創木基的特征峰；1 512～1 515 cm-1峰位的吸收峰是木質素芳香環碳骨架振動產生的，有研究顯示吸收峰位置高于1 509 cm-1的木質素以愈創木基為主［14］，表明，牡丹中主要為愈創木基木質素。牡丹枝中這兩個特征峰的強度更為顯著（圖1），表明牡丹枝中的木質素含量更高，這與含量測定結果一致。

表2 牡丹不同部位的紅外光譜吸收峰歸屬

1 319～1 334 cm-1峰位的特征峰和1 106～1 108 cm-1峰位的吸收峰是木質素中紫丁香基結構單元的特征表達，從牡丹枝和果莢的紅外圖譜中檢出了這兩個峰，表明牡丹枝和果莢中也含有一定量的紫丁香基木質素。

另外，牡丹不同部位在1 726～1 736 cm-1峰位的吸收峰在位置和強度上存在較大差異（圖1）。有研究顯示，該位置的吸收峰與纖維素和木質素的相對含量有關，兩者占比越大，該吸收峰就越向波數低的位置移動［13，15］。由此可以得出牡丹果莢中纖維素和木質素的相對含量最高，其次為葉和枝。這與前述牡丹木質纖維素組成分析結果中的纖維素和木質素含量是枝＞葉＞果莢相反，造成這種現象的原因還需深入研究。

2.2 預處理樣品的GC-MS分析

GC-MS分析結果表明，牡丹不同部位經不同預處理方式處理所得上清液中的物質數量和種類有差異。

牡丹葉經兩種方法預處理后的上清液檢出物質種類差異較大，水浴加熱處理檢出6種物質，微波加熱處理則檢出16種物質，都檢出苯基乙烯衍生物和草酸衍生物；此外，微波加熱處理葉的上清液中還檢出酚結構類似物（甲氧基苯丙胺、二甲基苯氧基取代乙胺、氨甲基甲酸苯酯、硝基甲氧基取代苯基乙烯）。而牡丹果莢和枝經兩種方法預處理后上清液中檢出的化學成分數量相似，但種類不同。水浴-堿法和微波-堿法預處理果莢上清液中分別檢出了14種和15種成分，均檢出了甲醇、去甲偽麻黃堿、乙酸、1-羥基-2-丙酮、丁內酯、2-羥基桉葉素、D-甘露糖7種成分；在牡丹枝的兩種預處理上清液中都檢出了12種成分，均包括甲醇、草酸乙烯酯、2-呋喃甲醇、苯丙胺和苯基乙烯衍生物5種成分。

2.3 預處理樣品的FTIR分析

FTIR分析結果（圖2）顯示，微波-堿法和水浴-堿法處理后的牡丹三個部位樣品的光譜形狀和出峰位置基本相似，表明這兩種預處理方式對不同原材料的處理效果沒有顯著差異；而與未經預處理的原料相比，在1 726～1 736 cm-1以及1 238～1 245 cm-1附近的木質素特征吸收峰，強度顯著減弱，證明堿預處理確實可有效移除木質素；同時，1 512 cm-1的吸收峰峰型未發生顯著變化，但從1 512 cm-1位移到1 508 cm-1附近，上述結果均表明愈創木基發生破壞。此外，牡丹果莢和枝的光譜圖中，1 319～1 320 cm-1處的吸收峰未發生變化，表明這些預處理手段可能并不能有效破壞紫丁香基。預處理樣品在1 376 cm-1左右的峰，芳香環骨架振動和C-H鍵平面內拉伸的峰值減弱，表明預處理對半纖維素的化學鍵也造成了損傷；3 400、2 900 cm-1以及1 420 cm-1附近的吸收峰與纖維素的O-H拉伸、C-H拉伸和芳香環骨架伸縮振動有關，峰強度未發生明顯變化，這意味著堿預處理未破壞纖維素［18］。

2.4 發酵可利用還原糖的產量

本研究結果（圖3）顯示，葡萄糖濃度在0.52～5.20 mg／mL范圍內，OD540（y）與濃度（x）呈線性相關，得標準曲線y＝0.223x＋0.114，R2＝0.988。

根據標準曲線計算出牡丹不同部位（葉、果莢、枝）的還原糖含量。由表3可見，果莢和枝還原糖產量不同預處理間沒有顯著差異；但微波處理的牡丹葉還原糖產量較水浴處理提高41.30%；兩種預處理方式中，果莢還原糖產量較葉和枝提高了46.62%～110.92%。

表3 不同預處理方式的牡丹不同部位廢棄物還原糖產量 （mg／mL）

3 討論與結論

傅里葉變換紅外（FTIR）光譜主要用于研究分子結構與紅外吸收譜線的關系，也被廣泛用于木材結構與化學成分的研究［17］，雖然基團的吸收振動峰位置會因具體化學結構的不同有些許差異，但仍會出現在特定的區域，因此，對紅外吸收峰進行歸屬，對于木質結構的分析和成分的判斷有重要意義。本研究結果表明，牡丹葉、果莢和枝中含有豐富的纖維素，綜纖維素含量在36.19% ～56.09%之間，牡丹枝中含量最高；FTIR分析顯示其木質素為SG型（即紫丁香基和愈創木基木質素），以愈創木基木質素為主，并確證牡丹枝中的木質素含量最為豐富。

堿性溶液被證實可有效去除木質素而不降解碳水化合物［19］，而且較高濃度的NaOH（1.0%、1.5%和2.0%）預處理可有效提高還原糖產量［20］。因此，本研究選擇2%的氫氧化鈉溶液（m／v）用于有效移除木質素。微波預處理可以縮短反應時間，加快產物形成，降低反應活化能［21，22］。本研究即對比分析了微波-堿法和水浴-堿法對牡丹枝、葉、果莢進行預處理的效果。經FTIR分析，預處理能有效破壞愈創木基、部分半纖維素，而不破壞纖維素，但是兩種預處理方式的FTIR峰型沒有明顯差別，表明兩種預處理方式對木質纖維素的破壞作用差異不明顯。對小麥秸稈的研究發現，半纖維素分解可產生羧酸衍生物，木質素降解則產生單酚類衍生物［23］。本研究中GC-MS在預處理葉的上清液中檢出這兩種成分，與FTIR分析結果一致，表明木質素和半纖維素被破壞，尤其是微波-堿法預處理上清中檢出酚結構類似物，表明微波-堿法對葉的木質素破壞作用更為明顯；同時，還原糖產量分析結果顯示，牡丹葉的微波預處理組還原糖產量是水浴預處理組的1.41倍，差異達顯著水平；結合GC-MS分析結果，牡丹葉微波-堿法預處理后的上清液中檢出16種化合物，遠高于水浴-堿法預處理（6種），這可能是因為堿性預處理能有效去除牡丹葉中的可溶性成分，間接提高綜纖維素的相對含量，導致其產糖量較水浴-堿法預處理的產糖量更高。

此外，D-甘露糖是半纖維素的單糖組成單元［24］，GC-MS在預處理牡丹果莢的上清液中同時檢出乙酸和D-甘露糖，均證明半纖維素被破壞。至于還原糖產量，在牡丹果莢和枝中，不同預處理的還原糖濃度沒有顯著差異，但果莢的還原糖產量要顯著高于葉和枝的。牡丹枝中的綜纖維素含量最高，但還原糖產量卻不及果莢。有研究表明，木質素填充于纖維素和半纖維素之間，阻礙纖維素酶的酶解效果，而堿預處理可有效移除部分木質素，促進纖維素酶與底物相互接觸［25］；另外，木質素的組成和結構也是影響發酵產糖效果的重要因素，原材料中的木質素含量越低，作為底物的生物利用性越好，纖維素酶解產糖量越高。牡丹枝中含有大量的木質素，堿預處理雖能有效去除木質素的愈創木基，但可能未有效破壞紫丁香基，這可能干擾了纖維素酶對纖維素的水解作用，最終導致其還原糖產量比牡丹果莢中的低。

綜上，牡丹不同部位廢棄物經過預處理都可用于制備發酵可利用還原糖，其中牡丹果莢的還原糖產量最高，較葉和枝提高了46.62%～110.92%；微波-堿法預處理較水浴-堿法預處理提高了牡丹三個部位材料的還原糖產量，對葉的還原糖產量影響顯著，但對果莢和枝的還原糖產量影響不顯著，因此，從簡便且經濟有效的角度考慮，水浴-堿法預處理可滿足對牡丹廢棄物預處理的要求，可用于后續的發酵還原糖制備。此外，本研究還使用FTIR結合GC-MS分析，從影響纖維素酶解的木質素移除效果和檢出成分兩方面，對兩種預處理方法的處理效果進行深入探究，闡述了還原糖產量存在差異的內在因素。該研究為牡丹廢棄物中木質纖維素的應用研究提供了有效的分析手段和數據，為制備發酵還原糖提供了有效原材料，為牡丹籽油生產過程中的廢棄物再利用提供新思路，有效解決其棄置帶來的環境危害和資源浪費。