松蘿煙酰胺的合成及抗腫瘤活性研究

連文靜，賀小瓊，趙 慶，王宜挺，吳 怡，尤雨桐

（1） 昆明醫科大學公共衛生學院,云南昆明 650500；2） 蘇州藥明康德新藥開發有限公司,江蘇蘇州 215104；3） 云南中醫藥大學中藥學院，云南昆明 650500；4） 中國科學院昆明植物研究所，云南昆明 650201；5） 昆明醫科大學科研實驗中心，云南昆明 650500）

松蘿屬于地衣門，松蘿科植物，近幾年松蘿的藥用價值引起了藥物化學領域的關注[1-3]，松蘿胺[C18H17NO6,6-乙酰基-2-（1-氨基-亞乙基）-7,9-二羥基-8,9b-二甲基-9bH-二苯呋喃-1,3-二酮]是從松蘿中提取的天然抗腫瘤活性物質，初步試驗結果證明對神經膠質瘤、人鼻咽癌細胞等有較強的體外抗癌活性[4-5]。

從植物中尋找分離活性化合物的方法效率低、時間長，而對天然活性先導化合物進行結構修飾可解決植物資源短，分離困難的難題，同時也是改善活性化合物毒性，減少毒副作用的高效方法[6]。經過對先導化合物的結構修飾改造，合成具有抗癌抗菌活性的新型結構衍生物一直是科研工作者們研究的熱點。

本次實驗受姜黃素煙酸酯[7]及香豆素煙酸酯[8]合成的啟發，選用具有促進代謝，調節血脂同時又可以作為藥物合成中間體[9-12]的煙酸作為酰化劑，新型高效堿性親核催化劑4-二甲氨基吡啶（4-Dimethylaminopyridine，DMAP） 作為催化劑，以 N,N'-二異丙基碳二酰亞胺 （N,Napos;-Diisopropylcarbodiimide，DIC） 作為脫水劑，通過酰化反應將煙酸連接到松蘿胺分子結構中制備有抗癌活性的衍生物，以期得到性狀優良的結構修飾產物，豐富抗癌候選藥物種類。

1 材料與方法

1.1 人癌細胞株

人鼻咽癌細胞（CNE2）、人膠質瘤細胞（U-251）、人結腸癌細胞（HCT-116） 均由云南省腫瘤醫院提供。

1.2 藥物試劑與儀器

松蘿胺（C18H17NO6） 由實驗室合成，經HPLC 鑒定，其純度大于99.8%。4-二甲氨基吡啶（DMAP） （九鼎化學科技有限公司），N，N-二異丙基碳二亞胺（DIC）、煙酸、二氯甲烷（分析純，均購自上海麥克林生化科技有限公司）。注射用順鉑（齊魯制藥有限公司，生產批號：8C0174B02）胰蛋白酶、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（均購自HyClone 公司）。

旋轉蒸發儀RE-2000B（上海亞榮生化儀器廠），循環水真空泵SHZ-D(Ⅲ)（上海力辰邦西儀器科技有限公司），超聲波清洗機SB-5200DTD（寧波新芝生物科技股份有限公司），Thermo Forma SeriesⅡ二氧化碳培養箱（美國Forma 公司），高效液相色譜儀L-2000（日本日立公司），紫外可見分光光度計U-3010（日本日立公司）。

1.3 方法

1.3.1 合成設計及原理 稱取松蘿胺343 mg，置于旋蒸瓶中，室溫下加入約100 mL 的二氯甲烷溶劑，超聲10 min 使松蘿胺完全溶解。稱量約246 mg 煙酸和約15 mg DMAP 加入旋蒸瓶中，邊攪拌邊加入約1 mL DIC，然后用錫箔紙密封，靜置反應，每隔1 h 取樣，用TLC 檢測反應情況，當有反應產物出現且不再變化時，停止反應。加入約3 mL 蒸餾水攪拌約20 min，然后將反應溶劑蒸干，拌樣上300～400 目硅膠柱，用石油醚：乙酸乙酯（3:1～1:1） 梯度洗脫，得到化合物N。合成設計線路見圖1。

圖1 合成設計線路Fig.1 Synthetic routes of compounds

1.3.2 體外抗腫瘤活性研究 采用MTT 法[13-15]，將對數生長期的腫瘤細胞接種于96 孔板中，濃度為6 000 個/孔，順鉑作為陽性藥物。24 h 后，棄去培養液加入含有不同藥物濃度的完全培養液，置于細胞培養箱中培養72 h，棄去原細胞培養液，加入200 μL 含有10%MTT 的完全培養液，再繼續培養4 h 后，棄去培養液，加入150 μL 二甲基亞砜，避光震搖10 min 后，置于酶標儀中檢測吸光度（A），檢測波長490 nm，計算對腫瘤細胞的抑制率。

實驗分組：（1） 空白對照組：不接種癌細胞，其他處理同實驗組；（2） 溶劑對照組：每1 mL 培養液中加入1 μL DMSO；（3） 陽性對照組：用PBS 將順鉑配制成2 μg/mL；（4） 藥物處理組：松蘿煙酰胺組濃度為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μmol/L，松蘿胺組濃度為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 μmol/L。

1.3.3 在不同溶劑中的溶解度測試[18-19]取適量的化合物N 用色譜甲醇稀釋至適量濃度，用紫外分光光度計做全波長掃描，確定其最大吸光波長223 nm，配制濃度為2、4、6、8、10 μg/mL 松蘿煙酰胺和松蘿胺標準溶液，取3 mL 置于紫外分光光度計中檢測，記錄吸光度，以檢測藥物濃度（X,μg/mL） 為橫坐標，吸光度值為縱坐標（Y） 繪制標準曲線。

松蘿煙酰胺在甲醇、無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇及正辛醇溶劑中的吸光度回歸方程分別為：Y=0.109X-0.080 4，R2=0.998 4；Y=0.078 3X-0.028 9，R2=0.9988；Y=0.083 9X-2E-05，R2=0.999 6；Y=0.096 4X-0.007 4，R2=0.999 4；Y=0.071 4X-0.004 3，R2=0.999 1。

松蘿胺在甲醇、無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇及正辛醇溶劑中的吸光度回歸方程分別為：Y=0.098X-0.022 3，R2=0.999 6；Y=0.088 6X-0.076 5，R2=0.998 6；Y=0.121X-0.056 7，R2=0.999 3；Y=0.095 7X-0.016，R2=0.999 8；Y=0.100 3X+0.027 6，R2=0.998 5。

帶塞三角燒瓶中分別倒入約20 mL 甲醇、無水乙醇、75%乙醇、50%乙醇及正辛醇，分別加入過量的松蘿胺和化合物N，每個樣品平行三份。置于恒溫搖床上震搖24 h，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取3 mL 置于紫外分光光度計中檢測。

1.4 統計學處理

用統計軟件進行數據分析，樣本數據服從正態分布，采用單因素方差分析，數據結果用（±s）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 化合物N 的波譜數據

化合物N 為淡黃色粉末，收率31.8%；1H NMR (500 MHz,CDCl3)δ12.12 (s,1H),11.97 (s,1H),9.40(s,1H),8.90(d,J=4.3 Hz,1H),8.56 (d,J=8.0 Hz,1H),7.59(dd,J=7.9,5.1 Hz,1H),7.06(d,J=15.1 Hz,1H),5.78 (s,1H),2.60 (s,3H),2.46 (s,3H),2.09(s,4H),1.73(s,4H)。

13C NMR(126 MHz,CDC13)δ197.96(C),194.17(C),190.20(C),175.41(C),173.64(C),163.91(C),156.25(C),155.31(C),152.59(CH),150.33(CH),148.83(C),139.13(CH),126.10(C),124.16(CH),116.42(C),113.15(C),108.65(C),102.79(CH),101.57(C),56.89(C),32.61(CH3),31.69(CH3),26.07(CH3),8.83(CH3)。

經專家鑒定得到化合物E） -N-(1-(6-乙酰基-7,9-二羥基-8,9b-二甲基-1,3-二氧代-3,9b-二氫二苯并[b，d]呋喃-2(1-H)-亞烷基)乙基)異煙酰胺，分子式為C24H20N2O7，分子量448；中文名為煙酰松蘿胺，結構式見圖2。

2.2 體外抗腫瘤活性測試

與陰性對照組相比，新化合物松蘿煙酰胺在不同濃度下對CNE2、U251、HCT-116 腫瘤細胞均有不同程度的抑制，IC50 分別為（1.68±0.51）、（2.14±0.41）、（1.93±0.13） μmol/L。在三種測試細胞株中，對HCT-116 細胞的抑制作用最強。相同條件下松蘿胺對三種腫瘤細胞的IC50 分別為（1.53±0.14）、（1.48±0.3）、（1.40±0.07）μmol/L。實驗結果見表1、表2。

2.3 溶解度測試

松蘿胺經酰化反應后得到的化合物松蘿煙酰胺在正辛醇溶劑及75%乙醇溶劑中的溶解度提升，在甲醇及無水乙醇溶劑中的飽和溶解度下降，見表3。

圖2 化合物N 的結構圖Fig.2 Structure diagram of compound N

表1 松蘿煙酰胺對CNE2、U251、HCT-116 細胞作用72 h 的抑制率［（±s），n=3］Tab.1 Inhibition rate of usnea nicotinyl amine on CNE2,U251 and HCT-116 cells for 72 h［（±s），n=3］

表1 松蘿煙酰胺對CNE2、U251、HCT-116 細胞作用72 h 的抑制率［（±s），n=3］Tab.1 Inhibition rate of usnea nicotinyl amine on CNE2,U251 and HCT-116 cells for 72 h［（±s），n=3］

與溶劑對照組比較，**P ＜0.01。

表2 松蘿胺對CNE2、U251、HCT-116 細胞作用72 h 的抑制率［（±s），n=3］Tab.2 Inhibition rate of usenamine on CNE2,U251 and HCT-116 cells for 72h［（±s），n=3］

表2 松蘿胺對CNE2、U251、HCT-116 細胞作用72 h 的抑制率［（±s），n=3］Tab.2 Inhibition rate of usenamine on CNE2,U251 and HCT-116 cells for 72h［（±s），n=3］

與溶劑對照組比較，**P ＜0.01。

表3 在不同溶劑中的飽和溶解度測試結果［（±s），n=3］Tab.3 Saturated solubility test results of two compounds in different solvents［（±s），n=3］

表3 在不同溶劑中的飽和溶解度測試結果［（±s），n=3］Tab.3 Saturated solubility test results of two compounds in different solvents［（±s），n=3］

與松蘿胺比較，**P ＜0.01。

3 討論

長松蘿有抗炎、抗菌、抗氧化、抗輻射等作用，具有清熱解毒、祛濕止痛、祛痰止咳、清肺熱等功效[2，20-22]，同時也是蒙藥的常用藥材[23]，松蘿胺作為長松蘿的抗腫瘤活性成分被發現，本課題組近年來一直致力于松蘿胺的研究，本次實驗是首次對松蘿胺的結構進行修飾，通過酰化反應將煙酸連接到松蘿胺的氨基中，得到一個未見報道的化合物松蘿煙酰胺。經過體外活性測試，結構修飾物松蘿煙酰胺具有抗腫瘤活性，對人鼻咽癌細胞、人膠質瘤細胞、人結腸癌細胞有明顯的增殖抑制作用。說明松蘿胺的氨基可作為結構修飾的位點連接基團，其產物松蘿煙酰胺仍具有抗癌活性，且在含水乙醇和正辛醇溶劑中的飽和溶解度提高。

在本次實驗中采用高效催化劑DMAP，其催化效果顯著優于無水吡啶，且用量少；DIC 作為脫水劑在反應過程中產生的副產物較少，容易水解去除。整個合成線路簡單，反應條件溫和，后處理及操作簡單且容易控制，對松蘿胺結構修飾及優良抗癌活性化合物的發現具有重要的參考意義。