支原體DNA 載量和耐藥基因23SrRNA 的2063 和2064 位點突變檢測在兒童支原體肺炎診療的應用

丁臻博，段 晶，魯 萍，黃永坤，趙亞玲，羅 艷

（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科，云南昆明 650032）

兒童肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）：又稱原發(fā)性非典型肺炎，因肺炎支原體（mycoplasmapneumoniae，MP） 感染所引起的肺部炎癥，是學齡兒童及青少年常見的一種肺炎。主要通過呼吸道飛沫傳播，近年嬰幼兒發(fā)病增多。全年皆可發(fā)病，3～7 a 流行1 次[1]，占住院兒童社區(qū)性獲得肺炎的10%～40%，MP 流行時可以增加至3～5 倍[2]，近年來臨床發(fā)病率增高趨勢明顯。病程持續(xù)2～3 周左右，以發(fā)熱，似百日咳樣陣發(fā)性劇烈干咳為主要表現(xiàn)。因MP 體外培養(yǎng)需要時間長，病原菌免疫檢測特異性抗體產(chǎn)生2周，故不能盡早診斷，近年來MP 對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥性越來越強，尤其是23SrRNA 基因突變，各個地區(qū)對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥率差別明顯不同[3]，給臨床診療帶來困擾。本研究通過于PCR 方法快速檢測呼吸道分泌物MP-DNA 載量早期診斷，同時檢測抗生素作用靶位23SrRNA 的2063 和2064 位點基因突變情況判斷是否耐藥，為臨床診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年3 月至2019 年9 月昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院兒科因下呼吸道感染住院患兒224例為研究對象，其中男122 人，女102 人。年齡為1～13 歲，平均（5.57±3.34） 歲，入院24 h 嚴格規(guī)范采集痰液和咽拭子的呼吸道分泌物標本并及時送檢。納入標準：（1） 根據(jù)《諸福棠實用兒科學》第8 版MPP 診斷標準[1]；（2） 年齡0～14歲兒童；（3） 臨床資料完整。排除標準：（1）既往免疫功能異常；（2） 重癥肺炎未痊愈；（3）合并結(jié)締組織和先天性免疫功能缺欠。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 所用 PCR 儀為宏石SLAN-96P 實時熒光定量PCR 儀，試劑為江蘇默樂生物科技股份有限公司生產(chǎn)的MP 核酸及耐藥突變位點檢測試劑盒（熒光PCR 法），嚴格按照試劑和儀器的說明書操作。

1.2.2 檢驗方法（1） DNA 提取：采用熱裂解法對收集的咽拭子、痰液樣本進行操作。①咽拭子樣本：加入1 mL 左右的無菌生理鹽水，充分振蕩混勻后，吸取上清400 μL，13 000 r/min 離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入50 μL 裂解液和5 μL 內(nèi)標液，充分振蕩混勻后，100℃恒溫處理10 min，冷卻至室溫，13 000 r/min 離心2 min，上清液即為DNA 模板。②痰液樣本：加等體積無菌生理鹽水，充分振蕩1 min，吸取上清400 μL，13 000 r/min 離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入50 μL 裂解液和5 μL 內(nèi)標液，充分振蕩混勻后，100℃恒溫處理10 min，冷卻至室溫，13 000 r/min離心2 min，上清液為DNA 模板。（2） DNA 擴增：配置PCR 反應液，將裝有PCR 反應液的PCR反應管中分別加入制備好的標本5.0 μL，同時做質(zhì)控樣本和陰性對照。PCR 反應擴增參數(shù)：50℃2 min；95℃2 min；91℃15 s，64℃1 min，40 個循環(huán)。熒光信號的收集定為FAM（2063 或2064 A:G突變）、VIC（MP）、CY5（內(nèi)標）。

1.2.3 結(jié)果判讀 熒光定量PCR 的結(jié)果以Ct 值顯示，其中陰性對照的目的基因應為UNDET 或FAM熒光Ct≥35.33、VIC 熒光Ct≥35.01，強陽性對照的目的基因Ct 值均位于20.00～25.00 之間；弱陽性對照的目的基因Ct 值均位于29.00～34.00 之間；內(nèi)標的Ct 值應≤35。結(jié)果判定標準如下：（1） 檢測樣本顯示UNDECT 或無典型S 型擴增曲線時，為陰性樣本，檢測樣本FAM 熒光（2063 或2064 A:G 突變） Ct≥35.33、VIC 熒光（MP） Ct≥35.01時，為陰性樣本，表明無MP 感染，未發(fā)生2063或2064 突變；（2） 檢測樣本FAM 熒光Ct≥35.33、VIC 熒光Ct＜35.01 時，為陽性樣本，表明MP 陽性，未發(fā)生A2063 或2064 耐藥突變；（3）檢測樣本FAM 熒光Ct＜35.33、VIC 熒光Ct＜35.01時，為陽性樣本，表明MP 陽性，發(fā)生A2063G 或2064G 耐藥突變。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)處理，突變和感染率等計數(shù)資料用n（%） 描述，組間比較采用Kappa 分析和χ2檢驗。計量資料服從正態(tài)分布用描述。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MPP 感染與MP-DNA 載量、23SrRNA 的2063 和2064 耐藥突變位點檢測情況

224 例下呼吸道感染中MPP 71 例，感染率為31.69%男41 例，女30 例（男：女=1.36），其中檢出MP-DNA 陽性27 例，陽性率：38%;男17 例，女10 例，（男：女=1.7），其中檢出23SrRNA 的2063 和2064 位點突變耐藥基因19 例，靈敏度為70.4%，特異度為100%，Kappa 值為0.746。說明基因檢測MP 結(jié)果特異度較高，一致性中等，見表1。以呼吸道分泌物檢測MP 結(jié)果為金標準，對基因檢測支原體結(jié)果進行診斷試驗的比較，靈敏度為19/27=70.4%，特異度為44/44=100%，Kappa 值為0.746。

2.2 不同指標的呼吸道分泌物檢測MP 結(jié)果比較

不同性別的分泌物檢測MP 陽性率比較，差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）。不同年齡的呼吸道分泌物檢測MP 陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

年齡和陽性率間存在線性趨勢，趨勢檢驗結(jié)果：隨著年齡增加，陽性率在增加χ2=4.324，P=0.0376，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 呼吸道分泌物檢測MP 結(jié)果和基因檢測MP 結(jié)果比較（n）Tab.1 Comparison of MP results for respiratory secretions and MP results for genetic testing （n）

表2 不同指標的呼吸道分泌物23SrRNA 的2063 和2064 位點突變檢測結(jié)果比較［n（%）］Tab.2 Comparison of detection results of 2063 and 2064 point mutations of 23SrRNA of respiratory secretions with different indexes［n（%）］

3 討論

近些年在我國很多地區(qū)，兒童MPP 發(fā)病率明顯提高，具有一定的流行性。本研究MPP 占下呼吸道感染的感染率為31.69%，其中MP-DNA 檢出率38%，隨著年齡增加，陽性率在增加，符合大多數(shù)國內(nèi)外報道10%～40%區(qū)間的報道[2-3]。MP在體外能夠進行自我復制且不依靠活細胞存活的最小微生物之一。MP 體外培養(yǎng)檢出診斷本病有接近100%特異度，但是培養(yǎng)過程復雜，Mp 菌株生長緩慢，需要經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)可能出現(xiàn)陽性反應，敏感度為34.78%[4]。培養(yǎng)周期2～4 周、體外分離培養(yǎng)比較困難，多用于實驗室研究，并不適用于臨床。在1967 年前后有學者研究[5-6]血清學檢測并逐漸應用于臨床。目前臨床上多采血液標本提取血清檢查顆粒凝集試驗抗體檢測，根據(jù)血清學檢驗結(jié)果還要結(jié)合患者的年齡、病程、一般情況等因素綜合分析，在兒科中對于抗體能力較低的嬰幼兒，免疫功能減低、缺陷的人群、產(chǎn)生低滴度或可能不產(chǎn)生抗體等。抗體可在部分治愈者機體會維持4 周左右陽性，期間再次感染患者很難再特定分析。與本研究采用快速PCR 技術檢測MP-DNA 載量比較，呼吸道分泌物DNA 檢測MP結(jié)果為金標準，特異度為100%，靈敏度為70.4%，后者有明顯的優(yōu)勢。本研究在常規(guī)MPP 其他輔助檢查基礎上進行呼吸道分泌物MP-DNA 載量檢測，用載量標記結(jié)果，縮短了診斷時間同時又量化可感染指標，及時準確的得到治療，在臨床工作中收到很好的效果。因咽拭子和痰液標本對于真實反應下呼吸道MP 感染存在差別，故本研究標本盡量采集痰液標本。近年報道難治性、嚴重甚至致命的MPP 病例增多。一些難治性MPP 患者中出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥和后遺癥，例如氣道閉塞，支氣管擴張，單側(cè)透明肺等嚴重后遺癥[2]。故早期檢測MP-DNA 載量的方法簡便、快捷、依從性好、特異性和靈敏性高等特點，為盡早診斷、及時治療避免并發(fā)癥和后遺癥等提供幫助，值得臨床工作中推廣。

從2000 年以來，MP 對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性迅速上升，特別在亞洲地區(qū)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的MP 感染的患者經(jīng)常表現(xiàn)為嚴重的MPP，也是確定早期兒童MP 感染能否發(fā)展為輕度或重度肺炎的指標[7]。因為MP 缺乏細胞壁，對于作用于細胞壁的抗生素青霉素、頭孢類抗生素等具有天然耐藥性，但是對四環(huán)素類，喹諾酮類，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感。由于四環(huán)素類，喹諾酮類藥物對于兒童處于生長發(fā)育、骨骼長成方面的不良作用，故兒童MP 感染后首選大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療[8]。根據(jù)Guo D X 等報道[9]822 名北京11 家醫(yī)院患兒中，341 名（41.48%） 通過巢式PCR 檢測出MP陽性，236 份（69.21%） 樣本23SrRNA 有突變[9]。Loconsole 等[10]報道三個具有大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因型：兩個和一個分別具有A2063G 和A2064G 突變。有多種研究顯示，23SrRNA 結(jié)構基因位點突變可導致抗生素與核糖體親和力下降而引起耐藥，突變導致的藥物結(jié)合靶點改變是Mp 對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的最重要原因，結(jié)構域Ⅴ區(qū)A2063G、A2064G 突變導致高水平耐藥，中國人DNA 測序23S rRNA 基因中高度流行的A2063G 突變，絕大多數(shù)在23SrRNA基因的2063 位顯示A至G取代[11-12]。故而可在臨床參考23SrRNA 基因突變位點進耐藥分析[13]，因此，本研究檢測MP 耐藥基因檢測23SrRNA 的2063 和2064 位點突變并判斷其突變與判定大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥是否具有可行性，為臨床治療加大劑量和療程提供依據(jù)。因為兒童應用靜脈輸注阿奇霉素注射液安全性存在爭議，筆者選擇安全性穩(wěn)定的紅霉素注射液靜脈滴注劑量：10～15 mg/(kg·次)，每天2 次，盡早開始足量、增加療程等治療，本研究中所有病人均轉(zhuǎn)歸良好，包括1 例合并多種細菌感染患者，未見治療無效病例，提示無論是否為MP 耐藥菌感染，對于兒童MPP 感染而言，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素仍為首選治療。臨床中發(fā)現(xiàn)對于不同種類的大環(huán)內(nèi)酯類藥物每個病人的敏感度有差別，所以因人選藥也是關鍵，進一步加強大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥性的監(jiān)測和監(jiān)管力度，保證規(guī)范合理使用，有效遏制其耐藥性發(fā)展是關鍵。MP 重癥感染合并多種并發(fā)癥且藥物治療不佳的病例報道日漸增多[14]。有學者認為臨床如遇MPP 發(fā)生耐藥的情況，可以考慮聯(lián)合使用廣譜抗生素以達到抗感染的目的，此外中藥也是有效控制耐藥MP 感染的方法之一[15-16]，因此對于MPP 采用早期、及時、準確、綜合的治療方法是行之有效的。

國內(nèi)外報道[17-18]MP 肺炎發(fā)病和嚴重程度與地區(qū)，氣象和環(huán)境等因素相關性，日本學者報道[19]上訴因素與耐藥因素有關。本研究主要為昆明地區(qū)患兒，昆明地區(qū)是屬亞熱帶高原山地季風氣候，季節(jié)和溫度變化不大，較其他研究比較嚴重病例發(fā)生率明顯減低，還需要加大樣本量和長期觀察，隨訪進一步研究來評估本地區(qū)發(fā)病特點。在本研究病例均為入院24 h 采集呼吸道標本，大部分為痰液的下呼吸道標本并及時送檢，不排除因標本質(zhì)量等因素對檢出結(jié)果的影響，因為對于兒童而言，配合度相對較差，需要操作人員規(guī)范熟練迅速的采集標本，所以盡早規(guī)范采集下呼吸道分泌物合格標本及時送檢是保障檢出率的關鍵，在此前提下進行臨床分析，對于病情評估、治療以及遠期預后等因素提供有利依據(jù)。此外關于MP-DNA 載量和耐藥基因23SrRNA 的2063 和2064 位點突變檢查費用隨著科技發(fā)展和人民生活水平的提高成為呼吸道感染的常規(guī)檢查。

綜上所述，MPP 在兒童社區(qū)獲得性肺炎比例較高，其分布具有年齡，季節(jié)性和地域等差異，對首選藥物大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有很高的耐藥性，呼吸道分泌物MP-DNA 載量的檢測在兒科中特異性和敏感性高、簡便易行、兒童依從性好等特點，對MPP 早期診斷提供有利依據(jù)；同時檢測呼吸道分泌物MP 耐藥基因23SrRNA 的2063 和2064 位點突變檢測對于及時指導應用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素減少嚴重病例、并發(fā)癥、后遺癥等至關重要[20]，值得臨床推廣應用。