腫瘤浸潤性免疫細胞對肺腺癌預(yù)后影響的研究

施春波 董長征 陳磊 翁磊

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。非小細胞肺癌是肺癌中最常見的亞型，其組織學(xué)亞型又以肺腺癌多見。目前關(guān)于肺腺癌治療與預(yù)后評估主要依據(jù)TNM分期，而手術(shù)切除是早期肺腺癌的治療手段[2]；雖然手術(shù)切除可以提高生存率，但是仍有近1/4的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)[3-4]。因此，準確評估肺腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險具有重要意義。免疫反應(yīng)是許多特異性細胞之間相互協(xié)調(diào)的過程，對肺腺癌臨床結(jié)局可造成一定的影響[5]。據(jù)報道，腫瘤浸潤性免疫細胞（簡稱免疫細胞）的功能和組成會隨著宿主免疫狀態(tài)變化而改變，并可能成為特定藥物的有效靶點。CIBERSORT（通過估計RNA轉(zhuǎn)錄物的相對亞群來識別細胞類型）是一種基于基因表達的反卷積算法，利用一組條形碼基因表達值來表示免疫細胞組成。與傳統(tǒng)的免疫組化、流式細胞術(shù)等試驗方法相比，CIBERSORT能全面、快速、準確地推斷22種免疫細胞在腫瘤中的相對浸潤比例[6]。近年來有不少研究采用該方法探討22種免疫細胞對預(yù)后的影響[7-9]。本研究利用CIBERSORT計算肺腺癌中22種免疫細胞的浸潤比例，并構(gòu)建免疫風(fēng)險評分模型及列線圖來預(yù)測肺腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)獲取 本研究肺腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于公共數(shù)據(jù)庫TCGA[10]。通過UCSC Xena網(wǎng)站（https://xenabrowser.net/）輸入關(guān)鍵詞“肺腺癌”下載TCGA數(shù)據(jù)庫中594例肺腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括正常肺組織樣本59例,肺腺癌組織樣本535例。同時獲取523例肺腺癌患者的臨床資料，包括性別、年齡、TNM分期、預(yù)后等。最后利用R軟件的limma包對下載的肺腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行校正。

1.2 腫瘤中免疫細胞浸潤狀態(tài)評估 利用CIBERSORT軟件對校正后的肺腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中22種免疫細胞的相對浸潤比例進行推算。首先，將校正后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上傳到CIBERSORT網(wǎng)站（http://cibersort.stanford.edu/），將算法設(shè)置為1 000排。數(shù)據(jù)集中每個樣本將會得到一個P值，最終篩選出P＜0.05的樣本作進一步研究。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0和R 3.5.3統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的連續(xù)變量比較，采用兩獨立樣本t檢驗；呈偏態(tài)分布的連續(xù)變量比較，采用Mann-Whitney U檢驗。繪制Kaplan-Meier曲線，采用log-rank檢驗比較不同復(fù)發(fā)風(fēng)險患者的總生存率。繪制ROC曲線分析復(fù)發(fā)預(yù)測模型的診斷效能。單因素Cox回歸模型用于分析單個變量對生存的影響，多因素Cox回歸模型用于分析與生存相關(guān)的獨立預(yù)測因子，利用Cox回歸模型分析中的回歸系數(shù)構(gòu)建列線圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 22種免疫細胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的差異表達 利用CIBERSORT篩選出517例P＜0.05的樣本進行研究，其中正常肺組織樣本56例，肺腺癌組織樣本461例。對22種免疫細胞在正常肺組織、肺腺癌組織中的表達進行比較，結(jié)果顯示除CD8+T細胞、幼稚的CD4+T細胞、激活的自然殺傷細胞（NK細胞）及激活的肥大細胞外，其余免疫細胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的表達比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1a（插頁）。主成分分析結(jié)果顯示，正常肺組織與肺腺癌組織的免疫浸潤情況有明顯的組偏聚類和個體差異，見圖1b（插頁）。

圖1 腫瘤浸潤性免疫細胞在正常肺組織與肺腺癌組織中的差異表達（a：小提琴圖，藍色代表正常肺組織，紅色代表肺腺癌組織，NK細胞為自然殺傷細胞；b：主成分分析圖，紅色代表正常肺組織，綠色代表肺腺癌組織）

圖2 免疫風(fēng)險評分模型（a：Kaplan-Meier生存曲線；b：ROC曲線；c：風(fēng)險評分；d：生存狀態(tài)；e：免疫浸潤模式）

2.2 22種免疫細胞對肺腺癌患者預(yù)后的影響 利用單因素Cox回歸模型對22種免疫細胞進行分析，以尋找與肺腺癌總生存有統(tǒng)計學(xué)差異的預(yù)后亞群。結(jié)果顯示嗜酸性粒細胞（HR=4.08E+17，95%CI：1 560.24～1.07E+32，P＜0.05）、激活的樹突狀細胞（HR=79.44，95%CI：1.54～4 107.17，P＜0.05）、M1 型巨噬細胞（HR=30.42，95%CI：1.24～747.63，P＜0.05）均與肺腺癌預(yù)后較差有關(guān)，見表1。

2.3 基于3種免疫細胞的免疫風(fēng)險評分模型構(gòu)建與評價 假設(shè)上述單因素Cox回歸分析篩選的3種免疫細胞對肺腺癌的總體生存有影響，將這3種免疫細胞作為一個獨立的預(yù)測信號來預(yù)測患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險。采用多因素Cox回歸法對這3種免疫細胞構(gòu)建免疫風(fēng)險評分模型。根據(jù)模型對每例患者進行復(fù)發(fā)風(fēng)險評分，按風(fēng)險評分中位值將患者分為高風(fēng)險組與低風(fēng)險組，Kaplan-Meier曲線提示高風(fēng)險組患者總生存率低于低風(fēng)險組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2a（插頁）。ROC曲線顯示，該風(fēng)險模型在預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險方面具有較好的診斷效能（AUC=0.60），見圖2b（插頁）。肺腺癌患者的風(fēng)險評分、生存狀態(tài)及免疫浸潤模式見圖2c-e（插頁）。

表1 22種腫瘤浸潤性免疫細胞對肺腺癌患者預(yù)后的影響

2.4 免疫風(fēng)險評分模型對肺腺癌預(yù)后的獨立預(yù)測價值 為探索構(gòu)建的免疫風(fēng)險評分模型對肺腺癌預(yù)后風(fēng)險的預(yù)測是否獨立于患者年齡、性別、TNM分期等臨床病理參數(shù)，筆者對免疫風(fēng)險評分、年齡、性別、TNM分期進行了多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示免疫風(fēng)險評分模型（HR=1.30，95%CI：1.20～1.40，P＜0.05）、TNM 分期（HR=1.70，95%CI：1.49～2.10，P＜0.05）是肺腺癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子。

2.5 預(yù)測肺腺癌患者生存率的列線圖構(gòu)建 建成的預(yù)測肺腺癌患者生存率的列線圖見圖3。

3 討論

除惡性腫瘤細胞外，癌組織還包括免疫細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞以及大量細胞因子、趨化因子、生長因子。這些組件及它們之間的相互作用構(gòu)成了腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境對惡性細胞具有抑制作用，但是腫瘤細胞在進展過程中會避開這些抑制性信號，利用免疫細胞及其他有利條件促進自身的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[11]。眾所周知，在免疫細胞和腫瘤基質(zhì)中的惡性細胞之間，事實上存在著復(fù)雜的生物學(xué)過程，且具有明顯的預(yù)后相關(guān)性。例如在結(jié)直腸癌患者中，M1型巨噬細胞及激活的樹突狀細胞與較好的預(yù)后相關(guān)，而M2型巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞與預(yù)后不良相關(guān)[12]。Zhou等[9]基于免疫細胞構(gòu)建了預(yù)后免疫風(fēng)險評分模型，該模型是結(jié)腸癌患者無復(fù)發(fā)生存的獨立預(yù)測因子，且較TNM分期有更好的預(yù)測價值。

圖3 預(yù)測肺腺癌患者生存率的列線圖

手術(shù)切除后腫瘤復(fù)發(fā)是影響肺腺癌患者總生存的重要因素之一。因此，準確評估患者復(fù)發(fā)風(fēng)險對于肺腺癌患者總生存的改善至關(guān)重要。為了全面探索免疫細胞預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后的價值，筆者采用CIBERSORT對肺腺癌組織中22種免疫細胞的相對浸潤比例進行推算，并選取P＜0.05的樣本用于研究。單因素Cox回歸分析顯示，嗜酸性粒細胞、激活的樹突狀細胞及M1型巨噬細胞均與肺腺癌患者較差的預(yù)后相關(guān)。基于這3種免疫細胞，筆者采用多因素Cox回歸模型構(gòu)建了免疫風(fēng)險評分模型，而ROC曲線分析顯示該模型預(yù)測肺腺癌復(fù)發(fā)風(fēng)險是可靠的。此外，本研究發(fā)現(xiàn)幼稚B細胞、記憶B細胞、漿細胞、CD4+T細胞、濾泡輔助T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、NK細胞、肥大細胞、單核細胞等對肺腺癌預(yù)后的預(yù)測價值雖然不大，但是在正常肺組織與肺腺癌組織中存在差異表達，表明這些細胞與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，本研究證明了免疫細胞在肺腺癌預(yù)后評估中的價值，本文基于3種免疫細胞構(gòu)建的免疫風(fēng)險評分模型是肺腺癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子。但本研究不可避免地存在一定的局限性：（1）公開數(shù)據(jù)庫集中發(fā)布的數(shù)據(jù)量有限，本研究用于分析的臨床病理參數(shù)不全面，可能導(dǎo)致潛在的錯誤或偏倚；（2）未考慮與免疫浸潤位置相關(guān)的免疫微環(huán)境的異質(zhì)性；（3）為構(gòu)建免疫風(fēng)險評分模型而下載的所有數(shù)據(jù)均來自西方國家，因此該研究成果在亞洲國家患者身上不一定適用，需要進一步研究加以驗證。