結(jié)直腸癌的免疫微環(huán)境研究

張之亮 蘇琳

結(jié)直腸癌( colorectal cancer，CRC）是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國的惡性腫瘤中發(fā)病率中居 3-5位[1-2]，世界范圍內(nèi)CRC 預計新增 136萬新發(fā)病例和69萬死亡病例，超過一半的CRC患者容易發(fā)生復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移。目前，結(jié)直腸癌的臨床檢測主要是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability， MSI）、RAS基因、BRAF基因等。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展一個重要途徑，其可以導致腫瘤細胞內(nèi)基因突變的大量產(chǎn)生，進而形成大量新的抗原，增加機體的免疫識別和免疫應答，產(chǎn)生抑制腫瘤的狀態(tài)[3-5]。FDA 已批準免疫抑制劑用于患有微衛(wèi)星高不穩(wěn)定型（MSI-H）或錯配修復缺陷型（dMMR）轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者[6]。RAS基因是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的下游基因，RAS基因突變可以激活RAS/MAPK信號通路，導致結(jié)直腸癌對抗EGFR靶向藥物產(chǎn)生耐藥[7-9]，免疫耐受及逃避機制在癌癥進展中發(fā)揮著重要作用[10]。腫瘤免疫微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）[11]對于抗腫瘤起著重要作用，腫瘤微環(huán)境由非腫瘤細胞（如腫瘤相關(guān)成纖維細胞）、構(gòu)成腫瘤新生血管的內(nèi)皮細胞和周細胞、免疫和炎性細胞、骨髓來源細胞和胞外基質(zhì)組成，它們產(chǎn)生生長因子、化學因子和基質(zhì)降解酶，促進腫瘤的增殖和遷移[12-13]。目前的結(jié)直腸癌免疫治療方法僅對部分亞型表現(xiàn)出良好的免疫應答率，大部分患者免疫應答率仍然較低在本文中，我們將闡述結(jié)直腸癌的免疫微環(huán)境的特征以及對于臨床的免疫治療提供指導價值。

1 一般資料與方法

1.1 結(jié)直腸癌表達譜數(shù)據(jù)檢索與整理

TCGA數(shù)據(jù)庫下載美國Illumina公司RNA-seq的level3數(shù)據(jù)，為了保證數(shù)據(jù)的準確性，我們對數(shù)據(jù)進行了預處理。最終，我們共獲得了437例結(jié)直腸癌 RNA數(shù)據(jù)及相關(guān)的臨床信息(性別、年齡、生存狀態(tài)和生存期等)。美國國立生物技術(shù)中心的GEO數(shù)據(jù)庫中下載項目集分別是GSE42284（n=188）和GSE24551（n=160）且這兩個數(shù)據(jù)集都帶有臨床數(shù)據(jù)。

1.2 分層聚類分析

采用單個樣本聚類的分析方法（ssGSEA）把表達譜數(shù)據(jù)解析出29種免疫的細胞、免疫因子和免疫通絡(luò)的豐度，我們利用ESTIMATEA軟件評估免疫細胞分值、基質(zhì)細胞的分值以及免疫純度分值。利用層次聚類的方法，把結(jié)直腸癌的樣本進行免疫分型。

1.3 基因集變異功能富集和22種免疫細胞腫瘤浸潤豐度分析

基因集變異分析（GSVA），是一種非參數(shù)的無監(jiān)督分析方法，主要用來評估轉(zhuǎn)錄組的基因集功能富集結(jié)果。CIBERSORT是基于線性支持向量回歸的原理對免疫細胞亞型的表達矩陣進行去卷積的一個工具，可用RNA-Seq的數(shù)據(jù)來估計免疫細胞浸潤豐度。

1.4 生存曲線分析

針對我們篩選出來的結(jié)直腸中免疫微環(huán)境中的高中低免疫組，采用 Kaplan-Meier 法繪制生存曲線來預測總生存率，并使用時序檢驗（log-rank test）來檢驗高、低風險組生存曲線是否存在差異。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境分高中低免疫組

TCGA下載的結(jié)直腸癌的RNA-seq數(shù)據(jù)，基于ssGSEA解析出來29種免疫的細胞、免疫因子和免疫通絡(luò)的豐度，通過層次聚類可以把結(jié)直腸癌中的免疫微環(huán)境分為高中低免疫組（圖1a），并且這種方法在GSE42284數(shù)據(jù)集中進行同樣分析，結(jié)果顯示GSE42284數(shù)據(jù)集的樣本也能分為高中低免疫組（圖1b）。

2.2 結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境分高中低免疫組通路和22種免疫細胞的差異

基于GSVA分析，篩選出每個樣本的基因富集的豐度的通路矩陣，高免疫組vs.低免疫組進行差異通路分析，基于這些差異通路進行有監(jiān)督聚類分析（圖2a），通過熱圖可以看到intestinal immune network for IGA production、natural killer cell mediated cytotoxicity ，toll like receptor signal pathway 、hematopolietic cell lineage等通路在高免疫組的活性高于低免疫組。基于CIBERSORT[14]軟件評估的22種免疫細胞的豐度在高中低組免疫的差異（圖2b）。T cells CD8、T cells follicular helper、Macrophages M1和 Dendritic cells resting等免疫細胞的豐度在高免疫組高于低免疫組。然而Macrophages M0 、Macrophages M2 、T cells CD4 memory resting 等在高免疫組低于免疫組。

2.3 結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境分高中低免疫組CD274和CTLA4的表達以及生存曲線分析

圖1 基于ssGSEA解析的結(jié)果，在TCGA數(shù)據(jù)庫和GSE42284數(shù)據(jù)集中，結(jié)直腸癌分為高中低免疫組，其中低免疫組（最左側(cè)）和高免疫組（最右側(cè)）用框標出，中間沒有框標出的是低免疫組。

CD274和CTLA4在TCGA數(shù)據(jù)庫中隨著免疫活性的增高，表達水平顯著性是增加（圖3a，b）。結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)，分別在TCGA和數(shù)據(jù)集GSE2455中分別進行高中低免疫組生存曲線分析（圖3c，d），通過圖中分析結(jié)果，可以看出在總生存期和DFS中高免疫組高于低免疫組。

3 討論

癌癥的發(fā)展是由于腫瘤細胞不斷地在逃避抗腫瘤免疫，而作為腫瘤細胞免疫監(jiān)視和免疫逃逸的發(fā)生部位[15]，腫瘤免疫微環(huán)境與CRC的發(fā)生、發(fā)展及預后等密切相關(guān)[16-17]。然而對于結(jié)直腸癌免疫微環(huán)境的特征分析研究很少。

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)表達譜數(shù)據(jù)，對結(jié)直腸癌的免疫微環(huán)境進行了高中低免疫組的亞型分析，且能夠在獨立數(shù)據(jù)集中驗證。研究顯示Macrophages M0 和Macrophages M2 在高免疫組低于免疫組，然而Macrophages M1在高免疫組低于免疫組。腫瘤組織中的巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中最多的免疫細胞，可以分泌多種細胞因子，在腫瘤發(fā)生的初期，能夠識別并清除腫瘤細胞，但隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，又對腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移起著“雙刃劍”的作用。其中Macrophages M0 和Macrophages M2促進腫瘤的生長。T cells CD8和T cells follicular helper等免疫細胞的豐度在高免疫組高于低免疫組。浸潤腫瘤的T淋巴細胞，特別是CD8+T 細胞及與T細胞受體結(jié)合后產(chǎn)生IFN-γ、腫瘤壞死因子靶向腫瘤細胞，導致腫瘤細胞清除[18]。 濾泡輔助T細胞是一種新的CD4＋輔助性T細胞亞群，能持續(xù)分泌趨化因子受體而發(fā)生免疫作用。從而又激活對intestinal immune network for IGA production、natural killer cell mediated cytotoxicity ，toll like receptor signal pathway 、hematopolietic cell lineagede等免疫通路起到激活作用。盡管本研究未繼續(xù)深入探討免疫微環(huán)境影響結(jié)直腸癌不同免疫組的具體分子機制 ，但是我們的研究利用不同角度證明了高免疫組患者處于免疫激活狀態(tài)。且高免疫組與低免疫組比CD274的表達顯著性的增加。FDA已批準PD-L1免疫抑制劑應用于晚期實體瘤種[19-21]，如黑色素瘤、肺癌。因此，根據(jù)我們的方法篩選出來的高免疫組患者，可嘗試PD-L1免疫抑制劑治療的探索研究。

圖2 富集的通路（2a）和22種免疫細胞（2b）在結(jié)直腸癌高中低免疫組差異

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中CD274和CTLA4在高中低免疫組的表達（3a，b）以及 TCGA數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)集GSE24551中的結(jié)直腸癌高中低免疫組的生存曲線分析（3c，d）

綜上所述，免疫微環(huán)境逐漸成為腫瘤治療的熱點，現(xiàn)有的結(jié)直腸癌免疫治療方法僅對部分亞型表現(xiàn)出良好的免疫應答率，大部分患者免疫應答率仍然較低，仍需多中心、大樣本量研究，以滿足其在多數(shù)結(jié)直腸癌患者中的有效性與安全性，從而使更多患者獲益。結(jié)直腸癌免疫治療是一個有前景性的治療選擇，值得進一步研究探索。