呼吸道合胞病毒下呼吸道感染患兒外周血miR-145表達及與Th1/Th2平衡的關系

麥朗君， 翟佳羽， 林烈桔， 符學興

(海南省儋州市人民醫院兒科， 海南 儋州 571700)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)廣泛流行于世界各地，是導致嬰幼兒和兒童嚴重的毛細支氣管炎和肺炎常見病原體，主要表現為反復喘息[1,2]。但關于RSV下呼吸道感染發病機制至今仍不清楚，臨床癥狀與哮喘十分相似，推測其引起炎癥反應機制與哮喘相類似。大多數研究證明，輔助性T細胞亞群Th1/Th2的平衡失調導致的Th2型免疫反應是哮喘發病關鍵[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于高度保守非編碼RNA小分子，可調節細胞各種代謝活動，在疾病中發揮重要作用[4]。miRNA-145位于人類5號染色體長臂3區2帶(5q32)，在多種腫瘤中表達均明顯下調[5,6]。有研究發現，miR-145可以調節哮喘患者Th1/Th2平衡[7]。但是關于miR-145在RSV下呼吸道感染患兒中表達情況及其與Th1/Th2平衡間關系尚不清楚。因此本研究通過檢測RSV下呼吸道感染患兒外周血單個核細胞中miR-145、Th1、Th2亞群百分率等水平，以探究兩者間關系。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年6月至2019年11月本院兒科建卡就診的RSV毛細支氣管炎和肺炎患兒60例為實驗組，男性28例，女性32例，平均年齡(10.07±5.61)個月，毛細支氣管炎患兒31例，肺炎患兒29例。納入標準：①急性發病，病史在一周以內；②鼻咽部脫落細胞經堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶橋聯酶標法(APAAP法)檢測RSV抗原陽性；③無過敏性病史；④年齡≤3歲。排除標準：①病原檢測不單一，其他病毒核酸感染；②免疫缺陷；③先天性心臟病；④支氣管或肺發育不良；⑤先天性氣道畸形；⑥過敏史或家族哮喘史。另選取同期在本院體檢健康小兒60例為對照組，男性30例，女性30例，平均年齡(10.35±5.59)個月。兩組在性別、年齡上比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經儋州市人民醫院倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得受試小兒家屬知情同意并簽字，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2方 法

1.2.1樣品采集:患兒住院次日、健康小兒體檢當日采集外周靜脈血4mL，取出后室溫下立即取其中1mL加入無菌肝素抗凝管(20IU/mL)，通過流式細胞術檢測Th1/Th2細胞數量；余下3mL加入無菌肝素抗凝管離心(2000r/min，離心5min)，上層取血漿，用于ELISA檢測細胞因子白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-5(IL-5)表達水平，密度梯度離心法對外周血中單個核細胞進行分離。將血漿和外周血單個核細胞樣品置于-80℃保存，備用。

1.2.2流式細胞術檢測Th1細胞百分率、Th2細胞百分率:外周靜脈血標本中加紅細胞裂解液靜置后離心，棄上清，得到PBMCs調PBMCs細胞，分別加入PE、FITC雙色免疫熒光雙標記單克隆抗體及陰性對照孵育20min，PBS洗滌后，甲醛PBS固定，Attune NxT型流式細胞儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)檢測，計數5000個細胞中的IL-4+、IFN-γ+陽性細胞率。藻紅蛋白(PE)標記大鼠抗人IL-4單抗、異硫氫酸熒光素(FITC)標記的大鼠抗人IFN-γ單抗均購自北京義翹神州科技有限公司。

1.2.3熒光定量PCR檢測miR-145表達水平:采用RNA提取試劑盒(美國Molecular Research Center公司)提取血漿總RNA，反轉錄得cDNA。采用CFX96型qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)對miR-145進行擴增。qRT-PCR反應體系共10μL：miScript SYBR Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1μL，上下游引物(10 μM)各0.5μL，ddH2O 3.0μL。反應條件：95℃，90s；95℃，30s；63℃，30s；72℃，15s；45個循環。miR-145及內參U6的引物序列見表1。引物由上海生工生物公司設計合成；采用2-△△CT法對血清miR-145表達水平進行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4酶聯免疫法測定血漿中細胞因子水平:采用酶聯免疫法測定血漿中IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-5水平，檢測操作嚴格按照試劑盒說明書進行(IL-2、IL-4、IL-5 ELISA試劑盒均購自北京義翹神州科技有限公司，INF-γ試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司)。為控制檢測質量，本次研究所有樣品的檢測均由檢驗科同一批人員在同臺儀器上操作，每個樣本均設三次重復。

2 結 果

2.1各組外周血單個核細胞miR-145表達水平比較:實驗組miR-145表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

表2 各組外周血單個核細胞miR-145表達水平比較

2.2各組外周血Th1細胞百分率、Th2細胞百分率、Th1/Th2比值比較:實驗組外周血Th1細胞百分率、Th1/Th2比值顯著低于對照組(P<0.05)，兩組外周血Th2細胞百分率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 外周血Th1細胞 Th2細胞百分率比較

2.3各組血漿中細胞因子含量比較:實驗組血漿中IL-2、IFN-γ表達水平顯著低于對照組，IL-4、IL-5表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表4。

2.4實驗組外周血miR-145表達水平、Th1/Th2比值與細胞因子相關性分析:實驗組miR-145與IL-2、IFN-γ、Th1/Th2比值呈負相關(P<0.05)，與IL-4、IL-5呈正相關(P<0.05)，見表5。

表4 各組血漿中細胞因子含量比較

表5 miR-145與細胞因子水平相關性分析

3 討 論

RSV是引起嬰幼兒和老年人下呼吸道感染如支氣管炎和肺炎的常見病原體，導致患者住院甚至死亡。miRNA在多種腫瘤中作用已被研究者了解，有研究表明miRNA在免疫調控中同樣扮演十分重要角色，當其功能異?？蓪е露喾N免疫疾病發生[8]。目前針對miR-145研究多偏向腫瘤領域，而在免疫調控等研究較少[9]。近年研究發現miR-145與免疫調控關系密切，Li等[10]研究證實老年人血清中miR-145表達上調，影響老年人免疫功能調控。本研究發現，實驗組miR-145表達水平明顯高于對照組，說明miR-145可能與RSV下呼吸道感染有關。Fedele等[11]研究發現RSV誘導感染引發的哮喘與Th2反應增高有關。本研究發現與對照組比較，實驗組外周血Th1細胞百分率、Th1/Th2比值顯著下降，提示與患者相關的免疫功能變化以外周血Th1/Th2比值下降為主要表現。

原始輔助性T細胞根據分泌細胞因子種類不同分為Th1細胞、Th2細胞。TNF-α、IFN-γ、IL-2等細胞因子由Th1細胞分泌產生；IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細胞因子由Th2細胞分泌產生。李麗華等[12]研究發現，經過霧化吸入干擾素α2b注射液治療的RSV肺炎兒童病情明顯減輕，肺泡灌洗液中IL-2含量上升，證明IL-2可能發揮抗病毒作用，減輕肺部炎癥和損傷。彭智等[13]研究表明，IL-4含量增加可能與RSV感染有關。黃燕等[14]研究發現RSV感染的幼齡大鼠血清中IFN-γ含量顯著降低，說明IFN-γ在RSV下呼吸道感染中起重要作用。Mosquera等[15]國外研究表明，經過阿奇霉素預防RSV感染的小鼠支氣管肺泡中IL-5含量顯著降低，可見IL-5在RSV誘導的下呼吸道感染中具有一定作用，與呼吸道炎癥有關。本研究顯示與對照組相比，實驗組血漿中IL-2、IFN-γ含量顯著降低，IL-4、IL-5含量顯著升高，與之前研究相似，提示RSV下呼吸道感染患兒體內Th1相關炎癥因子水平降低，Th2相關炎癥因子水平升高。另外，實驗組miR-145與IL-2、IFN-γ呈負相關，與IL-4、IL-5呈正相關，提示miR-145可能通過影響機體中Th1、Th2相關炎癥因子水平，參與RSV下呼吸道感染。進一步研究發現，RSV下呼吸道感染患兒外周血miR-145表達水平與Th1/Th2比值呈負相關，提示miR-145可能通過對輔助性T淋巴細胞Th1和Th2亞群的比例進行調控，影響血漿中IL-2、IL-4、IFN-γ細胞炎癥因子的分泌，參與RSV下呼吸道感染過程。

綜上所述，RSV下呼吸道感染患兒外周血miR-145表達上調，與Th1/Th2比例呈負相關，可能通過調控IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-5等細胞因子表達，影響RSV下呼吸道感染發生。本研究不足之處在于樣本量過少，需擴大樣本量對RSV下呼吸道感染患兒外周血miR-145表達及與Th1/Th2平衡的關系進步一深入研究。