貴州金花茶種質資源ISSR分析及指紋圖譜庫構建

羅在柒 陸 俊 李榮京 李 治 珍李蘭

（貴州省林業科學研究院，貴州貴陽550005）

貴州金花茶的模式標本于1958年由中國科學院植物研究所的曹子余先生采自貴州省冊亨縣山區，被鑒定為中越山茶（Camellia indochinensisMerr），1993年昆明植物所的閣天綠等將其定名為貴州金花茶［1］，但張宏達等進一步將分布在冊亨的論證為離蕊金花茶（Camellia liberofilamentaH.T.Chang et C.H.Yan）［2］，分布于貴州省南部羅甸縣大亭鄉的金花茶為貴州金花茶。貴州金花茶自然分布地域狹窄、種群數量少，加之遭受人為采挖、生境破壞等影響，如今野生植株數量甚微，野生種群處于瀕危滅絕的狀態。

貴州金花茶除了歸屬金花茶組共享“植物界的大熊貓”“茶族皇后”等聲譽外，其皆具觀賞價值、開發應用價值和科學研究價值。其花具有極高的觀賞價值，富含微量元素、氨基酸，以及黃酮、多糖等400多種人體必需的活性成分物質［3-5］。前期研究表明，貴州金花茶除具備茶飲保健功能外，還具有藥用功效，尤其在眼疾、皮膚病、心腦血管類后遺癥、糖尿病、高血壓、高膽固醇、高血脂和腸胃消化系統等疾病康復方面均有不俗表現［6-9］，具備食用和藥用開發價值。

簡單重復序列間區（Inter-simple Sequence Repeat，ISSR）［10］分子標記技術的引物設計簡單，多態性豐富，重復性好，成本低，同時兼有擴增片段長度多態性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、簡單重復序列標記（Simple Sequence Repeats，SSR）和隨機擴增多態性DNA標 記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）分子標記的優點，已被應用于植物品種鑒定、遺傳圖譜構建、基因定位和輔助育種等研究［11，12］。

近年來，貴州省羅甸縣把金花茶產業作為發展地方經濟、助力脫貧攻堅的主抓產業，但是產業發展面臨種苗繁育、種植問題，尤其是急需摸清種質資源特征，因此要把好種苗源頭關。因此，本研究采用ISSR分子標記技術，開展對現存資源遺傳多樣性和DNA指紋圖譜特性的研究，對進一步深度開發和利用貴州金花茶奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

貴州金花茶（Camellia guizhouensisS.Y.Liang et T.L.Ming）新鮮葉片分別采集于羅甸縣冒井鎮大亭社區原生地周邊村寨、羅甸境內企業以及貴州省林業科學研究院樹木園引種植株（見表1）。試驗采用3個原生植株和8個引種植株，將普通油茶（Camellia oleiferaAbel.）作為對照。

表1供試樣品采集信息

由加拿大哥倫比亞大學設計100條ISSR引物序列UBC，編號依次為UBC 001～100。DNA提取試劑盒、瓊脂糖、Good View核酸染料、100 bp DNA ladder、2×Tap Master Mix和50×loading Buffer等均為BIOMIGA公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及檢測。稱取0.5 g新鮮葉片，液氮磨碎，使用BIOMIGA公司試劑盒提取DNA樣品，經1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為110 V、30 min。將成功提取的DNA樣品放入-40℃冰箱保存。

1.2.2 PCR擴增及檢測。使用上海生物技術有限公司合成的100對ISSR引物進行PCR擴增，選出其中多態性條帶較好的20對引物進行多態性擴增。PCR反應體系為總量20μL，其中2×Tap Master Mix 10μL、引物2μL、DNA模板1μL、ddH2O 7μL。

PCR擴增程序如下：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 min，72℃延伸30 min，35個循環，72℃退火5 min。

PCR檢測采用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增結果進行電泳，電泳條件為電壓110 V、80 min。之后在Tanon-2500數碼凝膠圖像分析儀上拍照保存，進行條帶分析。

1.2.3 數據分析。使用NTSYS2.1軟件對各樣品的PCR擴增結果進行聚類分析，做出相應聚類圖，分析各品種間的遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增與遺傳多樣性分析

獲得高質量的DNA為模板，對100對通用引物進行篩選，共選出22對擴增效果較好、條帶清晰的引物序列。擴增出的條帶大小在100～1 300 bp，共擴增出440條帶，其中多態性條帶為385條，多態性占比為87.5%，結果表明供試材料的ISSR多態性較豐富。

利用5條引物擴增出來的440譜帶建立11個金花茶品種的遺傳相似系數矩陣，見表2。各樣品之間的相似系數在0.39～0.84，平均相似系數為0.66，說明貴州金花茶樣品具有較高的遺傳多樣性。其中，田壩組1號和縣城益豐緣苗圃基地相似系數最大，為0.84，表明2個樣品之間的親緣關系相對較近；五湖公司基地9號與普通油茶相似系數最小，僅為0.39，表明9號與其他樣品的親緣關系相對較遠，該植株為廣西引種，是否為貴州金花茶需進一步鑒定。

2.2 貴州金花茶親緣關系聚類分析

對這22對引物做進一步篩選，共篩選出擴增效果較好、特異性強的UBC817、UBC825、UBC827、UBC844和UBC845這5對引物，共擴增出76個不同位點，其中多態性位點為63處，多態性為82.89%。Ntsys2.10軟件對11種金花茶的ISSR結果進行聚類分析，結果見圖1，系數為0.693時，10個貴州金花茶供試樣品分為2個組，即1號、2號、3號、4號、7號為一組，5號、6號、9號、10號為另一組，8號普通油茶作為對照組。

2.3 特異條帶分析與指紋圖譜構建

使用選定的5個擴增條數多、條帶清晰、特異性強的引物用作11供試樣品的指紋圖譜構建。擴增結果如圖2至圖6所示，U817號引物擴增的條帶大小在130～700 bp，共擴增出18位點，多態性位點為14處，多態性占比77.7%，可區分1號、2號、5號、7號、11號；U825號引物擴增的條帶大小在190～1 100 bp，共擴增出19條帶，多態性條帶為17條，多態性占比89.5%，可區分6號、9號、11號；U827號引物擴增的條帶大小在200～1 250 bp，共擴增出16條帶，多態性條帶為12條，多態性占比75%，可區分4號；U844號引物擴增的條帶大小在100～600 bp，共擴增出12條帶，多態性條帶為8條，多態性占比66.6%，可區分3號。U845號引物擴增的條帶大小在120～830 bp，共擴增出12條帶，多態性條帶為8條，多態性占比66.6%，可區分3號。根據10個ISSR引物的擴增結果，篩選出引物UBC017、UBC025、UBC027和UBC045擴增的51個多態性位點構建的DNA指紋圖譜，可用于鑒定供試10個貴州金花茶樣本。

表2遺傳相似系數矩陣

3 結論與討論

本試驗采用ISSR分子標記對10份貴州金花茶材料進行遺傳多樣性分析，結果表明貴州金花茶材料之間遺傳變異較豐富，同時呈現地域差異小的特點。樣品遺傳聚類分為2組，與調查過程中發現花瓣小花和大花2個類型相吻合，小花類型相對原生性相對較強，大花類型形態與離蕊金花茶較為相似，兩者之間的親緣關系仍值得深入研究。

本研究結果表明ISSR分子標記對貴州金花茶的親緣關系具有很好的分類效果，可為貴州金花茶育種的親本、雜種優勢選擇以及苗木品質鑒別提供理論基礎，對物種保護和產業化育苗種苗鑒別提供技術支持。