辛基酚對家蠶（Bombyx mori L.）生長發育的影響

袁紅霞，秦粉菊，顧華杰

（蘇州科技大學化學生物與材料工程學院，江蘇 蘇州215009）

隨著工農業生產的持續發展，越來越多的化學品被釋放到環境中。許多研究表明，一些化學品在環境中很難被降解，并可通過食物鏈在動物和人體組織中累積，引起內分泌干擾效應[1-3]。辛基酚（4-tert-octylphenol，4-t-OP）是辛基酚聚氧乙烯醚的降解產物，也是重要的精細化工生產原料，廣泛用于生產非離子表面活性劑、石油添加劑、農藥、涂料、增塑劑、除銹劑、潤滑油抗氧劑等[4-5]。因4-t-OP在生產生活中的廣泛使用，水體、土壤和空氣介質中都有一定濃度4-t-OP的累積，且其在自然環境中很難降解[6-7]。4-t-OP 是一種親脂性化合物，可快速被生物體吸收并在脂肪組織中累積[8]。因結構類似于雌激素，4-t-OP 已被確認為環境內分泌干擾物，顯示類雌激素效應[9-10]。

國內外已有4-t-OP 影響水生和陸生動物生長發育的毒性效應報道[10-13]。昆蟲是動物中物種數量最多、分布最廣泛、且對環境變化反應敏感的無脊椎節肢動物。其中鱗翅目昆蟲多與農業經濟密切相關，研究環境內分泌干擾物對鱗翅目昆蟲的影響有十分重要的理論和實踐意義。據所查國內外文獻，至今未見4-t-OP 對昆蟲影響的研究報道。家蠶（Bombyx moriL.）是國際無脊椎動物協會確認的模式昆蟲，是理想的毒理學、細胞生物學、疾病模型替代動物研究材料之一[14-15]。為此，本文以鱗翅目模式昆蟲家蠶為試驗對象，研究了4-t-OP 對家蠶生長發育的影響，旨在為探討酚類環境內分泌干擾物對鱗翅目昆蟲生長發育的干擾機制研究提供基礎資料，同時為昆蟲等無脊椎動物生態環境的保護與治理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗昆蟲為人工飼料攝食性很好的家蠶皓月品種，具有遺傳和發育的高度一致性。原種由江蘇省蠶種公司提供。4-t-OP（純度99%）購自Sigma-Aldrich公司。分析純無水乙醇購自上海生工生物工程有限公司。純桑葉粉人工飼料購自山東蠶業研究所。

1.2 藥物添加方法

用無水乙醇配制20 g·L-1的4-t-OP 母液，取適量4-t-OP母液與飼料干粉梯級混合法混合，加水充分拌勻，裝入保鮮袋后放進飯盒內高溫滅菌（120 ℃，20 min），低溫冷藏（4 ℃）。根據預試驗結果，實驗設4-t-OP 濃度為0（對照）、0.01、0.02、0.04 g·kg-1和0.08 g·kg-15 個處理，各處理均設3 次重復，每次重復飼養50頭蠶。

1.3 昆蟲飼養

蠶卵在22～25 ℃，相對濕度（Relative humidity，RH）75%～85%，24 h光照條件下保護至孵化。家蠶幼蟲生長發育經過4 眠5 個齡期，由卵剛孵化出的幼蟲形狀似螞蟻，稱蟻蠶。蟻蠶添食后稱1齡蠶，第1眠后稱2 齡蠶，第2 眠后稱3 齡蠶，第3 眠后稱4 齡蠶，第4眠后稱5 齡蠶，每眠1 次蛻皮1 次。蠶卵孵化后，置于人工氣候培養箱內飼養。家蠶幼蟲飼養方法為：1～3齡，27 ℃、RH 80%～85%；4～5 齡，25 ℃、RH 75%～80%。家蠶全齡（1～5齡）使用實驗要求的含一定濃度的4-t-OP 人工飼料添食，1 齡每3 日添食1 次，2～4 齡每2日添食1次，5齡每日1次更換人工飼料。每次起蠶后4 h 左右餉食。逐條蠶適熟上簇（開始吐絲結繭），25 ℃、RH 75%～80%條件下紙盒內單獨結繭，保護至成蟲羽化。

1.4 生長發育調查

收蟻后，調查家蠶24 h 疏毛率（剛毛舒展蠶的百分率）、48 h轉色率（體色轉變個體的百分率）、家蠶發育速度（幼蟲期和蛹期發育經過時間）、體質量變化（1～4 齡眠蠶和5 齡期家蠶1～7 日）和蛹期繭層質量。24 h 疏毛率和48 h 轉色率調查每處理3×50 頭。體質量調查中為了避免家蠶進食的影響，調查各齡（1～4齡）見起時（出現蛻皮蠶）的10 頭眠蠶體質量。為了解最大生長量變化，分別調查5 齡雌雄家蠶每日體質量（各10 頭）。在上簇后第8 d，調查各處理組蠶繭的全繭量和繭層量，并計算繭層率。

1.5 生命力調查

家蠶生命力調查以3 齡起蠶絕食生命時數、4 齡起蠶結繭率、蠶繭的死籠率（生命力相關的死亡率）和羽化率表示。在25 ℃、RH 75%～80%下每個處理取3×10頭3齡起蠶放入消毒培養皿中，逐頭記錄家蠶饑餓死亡時間，作為3 齡起蠶絕食生命時數。每個處理取3×30 頭4 齡起蠶，統計結繭蠶數，計算4 齡起蠶結繭率；開始結繭后第8 d，所結蠶繭全部剖開，統計良蛹數量，計算死籠率。羽化率指家蠶正常變態為成蟲的蠶蛹占調查蠶蛹數的百分率。

1.6 數據處理

數據分析采用SPSS 19.0軟件和Excel 2010。

2 結果與討論

2.1 4-t-OP對家蠶生長發育的影響

2.1.1 4-t-OP對蟻蠶疏毛率和轉色率的影響

家蠶蟻蠶（1 齡幼蟲）體表生有較多瘤狀突起，其上著生剛毛，開始取食后體表剛毛隨著體壁的伸展在表皮散開，呈疏毛癥狀，不同時間剛毛舒展的程度不同，蠶體色也趨淡，此時通稱“疏毛期”[16]。給蟻蠶添食4-t-OP 24 h 后調查疏毛率，48 h 后調查轉色率（圖1）。4-t-OP 添食處理對蟻蠶的疏毛率和轉色率有濃度效應，0.01 g·kg-14-t-OP 添食處理，蟻蠶24 h 疏毛率和48 h轉色率與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；0.02～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組蟻蠶24 h 疏毛率和48 h 轉色率與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其中0.08 g·kg-14-t-OP 添食組蟻蠶24 h 疏毛率和48 h 轉色率分別較對照組下降了60.0%和43.3%。

圖1 4-t-OP對家蠶1齡幼蟲疏毛率和轉色率的影響Figure 1 Effects of 4-t-OP on percentage of setae dispersion and body color change in 1st instar larvae

2.1.2 4-t-OP對家蠶發育速度的影響

由圖2 可見，0.01～0.02 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶幼蟲發育經過時間與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但蛹期發育經過時間比對照組顯著延長（P＜0.01）；而0.04 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶幼蟲發育經過時間和蛹期發育經過時間都比對照組顯著延長（P＜0.05 和P＜0.01）。0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶的幼蟲期與對照組相比有顯著差異（P＜0.01），幼蟲期整段發育時間比對照組延長了17.7%。0.08 g·kg-14-t-OP添食組蠶體質虛弱，蠶體大小出現明顯開差，開始吐絲后第8 日仍然未化蛹，最后全部成為死籠或不結繭蠶，無法完成整個世代。

2.1.3 4-t-OP對家蠶體質量的影響

圖2 4-t-OP對家蠶生長發育速度的影響Figure 2 Effects of 4-t-OP on the growth and development velocity of silkworm,Bombyx mori

圖3 4-t-OP對1～4齡家蠶幼蟲眠蠶體質量的影響Figure 3 Effects of 4-t-OP on the weight of dormant silkworm in the 1stto 4th instar larvae

圖3 為不同濃度4-t-OP 處理家蠶幼蟲1～4 齡眠蠶體質量的變化。0.01 g·kg-14-t-OP 添食組1～4 齡幼蟲眠蠶的體質量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05）；0.02 g·kg-14-t-OP 添食組1～3齡幼蟲眠蠶的體質量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），4 齡眠蠶的體質量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；0.04 g·kg-14-t-OP 添食組1 齡幼蟲眠蠶的體質量與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），2～4 齡眠蠶的體質量與對照組相比差異顯著（P＜0.05 或P＜0.01）；0.08 g·kg-14-t-OP添食組1～4 齡幼蟲眠蠶的體質量都較對照組體質量低，與對照組相比差異顯著（P＜0.05 或P＜0.01），0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶至4 齡時眠蠶體質量只有對照組的61.6%。從入眠速度看，0.01～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶從1 齡開始家蠶見眠時間都較對照組延長，而且組內個體入眠時間開差大、發育不齊。說明4-t-OP 對家蠶稚蠶的生長發育影響相對較小，但至大蠶期4-t-OP 的抑制作用逐步顯現，并且有濃度效應，4-t-OP 添食會影響家蠶的發育整齊度和發育速度，進而影響家蠶個體體質量。

為研究4-t-OP 對家蠶最大生長量的影響，進一步調查了5齡期家蠶每日體質量的變化（圖4）。家蠶幼蟲期一直添食4-t-OP，0.01～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組5 齡雄性和雌性家蠶體質量都分別比對照組雄雌家蠶體質量下降，且4-t-OP 對5 齡家蠶幼蟲體質量增加的抑制作用濃度效應明顯。0.01～0.04 g·kg-14-t-OP添食組家蠶5齡第1 d雌蠶體質量與對照組雌蠶體質量相比有所降低，但都沒有顯著差異（P＞0.05），0.08 g·kg-14-t-OP 添食組5 齡第1 d 雌蠶體質量與對照組雌蠶體質量相比顯著降低（P＜0.05）；0.01～0.08 g·kg-14-t-OP添食組家蠶5齡第2～7 d雌蠶體質量與對照組雌蠶體質量相比都顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）（圖4b）。0.04～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶5齡第1～7 d雄蠶體質量與對照組雄蠶體質量相比都顯著降低（P＜0.01）（圖4a）。0.08 g·kg-14-t-OP添食組5 齡雄蠶第7 d 體質量比對照組雄蠶體質量降低44.1%，5齡雌蠶第7 d體質量比對照組雌蠶體質量降低52.2%。由圖4 可見，4-t-OP 添食組雄蠶5 齡后期體質量停止增長的時間比對照組雄蠶早，5 齡雌蠶也有類似結果，4-t-OP 添食組家蠶幼蟲比對照組家蠶成熟早。

4-t-OP 對家蠶幼蟲群體發育整齊度和體質量增長的影響在低齡期（1～3 齡）不明顯，至大蠶期（4～5齡）影響加重，表明4-t-OP 在家蠶體內可能有累積作用，對家蠶生長發育的影響具有濃度-時間效應。這同袁紅霞等[17]報道的環境激素壬基酚對家蠶生長發育毒性具有濃度-時間效應，鐘儒杰等[18]報道的環境激素鄰苯二甲酸丁基芐酯對家蠶具有明顯的毒害作用，可顯著抑制家蠶的體質量和存活率，在蠶體內具有累積效應等結果類似。以上也說明環境內分泌干擾物對家蠶的生長發育毒性可能存在相似性。同時Yuan 等[19-20]研究表明壬基酚對家蠶的毒性與家蠶抗氧化保護酶活性和蛻皮激素受體基因表達有關,壬基酚對家蠶生殖發育具有毒性，但4-t-OP 是否也與上述壬基酚一樣能影響家蠶酶活性等還有待進一步研究證實。

2.1.4 4-t-OP對家蠶全繭量和繭層率的影響

圖4 4-t-OP對5齡家蠶體質量的影響Figure 4 Effects of 4-t-OP on the weight of silkworm in the fifth instar larvae

圖5 4-t-OP對家蠶全繭量和繭層率的影響Figure 5 Effects of 4-t-OP on the cocoon weight and the cocoon shell ratio of silkworm，Bombyx mori

在家蠶上蔟后第8 d，分別調查雌蠶與雄蠶全繭量和繭層率（圖5）。0.01～0.04 g·kg-14-t-OP 添食組雌蠶與雄蠶全繭量均比對照組蠶全繭量低，4-t-OP添食組雌蠶全繭量與對照組雌蠶全繭量相比差異不顯著，而0.04 g·kg-14-t-OP添食組雄蠶全繭量較對照組雄蠶全繭量顯著降低（P＜0.05）（圖5a）。4-t-OP 對家蠶全繭量這一重要經濟性狀的影響主要表現為降低了雄蠶全繭量。0.01～0.04 g·kg-14-t-OP 添食組雌蠶與雄蠶繭層率均低于對照組，但差異不顯著（P＞0.05），雄蠶繭層率高于雌蠶繭層率（圖5b）。0.08 g·kg-14-t-OP添食組家蠶幼蟲期全部不能結繭。

吐絲結繭是家蠶的本能之一，1～5 齡期家蠶絲腺細胞會隨著蠶體發育和器官快速生長而一起生長。幼蟲期攝食4-t-OP 的家蠶，隨著生長發育被抑制，其吐絲結繭生理功能也受到影響，4-t-OP 一定程度阻礙了絲物質的形成和分泌。內分泌的異常容易產生不結繭蠶，在4 齡摘除咽側體，20～30 h 后再移植咽側體，可造成絲腺退化；5 齡期用保幼激素添食，由于用量和添食時期不適當，生理功能發生紊亂會造成不結繭蠶[16]。0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶幼蟲期全部不能結繭，表明4-t-OP 對家蠶正常的吐絲結繭生理功能和行為有毒害作用，因此推測4-t-OP 作為一種具有類雌激素效應的內分泌干擾物質，通過干擾家蠶的內分泌，影響生理功能，使其生長發育速度減慢和蠶繭產量下降，嚴重時不能吐絲結繭并死亡。

2.2 4-t-OP對家蠶生命力的影響

2.2.1 4-t-OP對家蠶3齡起蠶絕食生命時數的影響

食下高濃度4-t-OP 會嚴重削弱1～2 齡稚蠶的體質，家蠶幼蟲的生命力下降。隨著4-t-OP添食濃度的增加，家蠶3 齡起蠶絕食生命時數呈現下降趨勢，0.04～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶3 齡起蠶絕食生命時數與對照組相比都顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。其中0.08 g·kg-14-t-OP添食組3齡起蠶絕食生命時數只有對照組的32.5%（圖6）。

2.2.2 4-t-OP 對家蠶4 齡起蠶結繭率、死籠率和羽化率的影響

圖6 4-t-OP對家蠶3齡起蠶絕食生命時數的影響Figure 6 Effects of 4-t-OP on the fasting survival hours of the newly molted 3rd instar larvae

圖7 4-t-OP對家蠶4齡起蠶結繭率、死籠率和羽化率的影響Figure 7 Effects of 4-t-OP on the percentage of cocoon,death pupa and adult of the 4thnewly molted larvae

4-t-OP 對家蠶4 齡起蠶結繭率、死籠率和羽化率有濃度效應（圖7）。0.01 g·kg-14-t-OP 添食組4齡起蠶結繭率與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），但0.02～0.08 g·kg-14-t-OP 添食組4 齡起蠶結繭率都比對照組極顯著降低（P＜0.01），其中0.08 g·kg-14-t-OP添食組家蠶幼蟲期全部不能結繭。表明0.02 g·kg-1以上濃度4-t-OP 對家蠶幼蟲吐絲結繭功能有嚴重不良影響。家蠶4 齡起蠶死籠率隨4-t-OP 處理濃度增加而增加，羽化率隨4-t-OP 處理濃度增加而降低。表明家蠶整個幼蟲期飼料中添加4-t-OP 在蠶體內有累積效應，對家蠶蛻皮、結繭、化蛹和羽化等變態發育影響有時間和濃度效應。4-t-OP 對家蠶發育的影響在化蛹和羽化的發育變態期更加明顯，濃度效應比幼蟲期更加明顯，這進一步提示4-t-OP對家蠶生長發育的影響具有時間效應，其在家蠶體內可能有累積作用。

4-t-OP 是一種具有類雌激素效應的內分泌干擾物質，在高等動物中與雌激素受體具有一定的親和力，通過干擾內分泌活動影響動物的生長發育[21]。家蠶的變態發育是形態和生理的轉變過程，由腦、前胸腺及咽側體等內分泌器官所分泌的激素來調控。體內保幼激素（Juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（Molting hormone，MH）的有無或高低直接調控了家蠶的生長發育[16]。家蠶結繭后化蛹和羽化困難，死籠率顯著升高，羽化率明顯下降，4-t-OP 是否也通過干擾JH和MH 或相關的激素受體合成而影響家蠶由幼蟲通過蛹期發育為成蟲的變態發育過程仍有待進一步深入研究。

3 結論

（1）家蠶幼蟲期添食0.01～0.08 g·kg-14-t-OP 能夠嚴重抑制家蠶的生長發育，對家蠶幼蟲生長發育、化蛹和羽化發育變態期影響具有濃度和時間效應。

（2）家蠶幼蟲期攝食0.01～0.08 g·kg-14-t-OP，幼蟲的生命力和吐絲結繭功能下降，4-t-OP 阻礙絲物質的形成。0.08 g·kg-14-t-OP 添食組家蠶幼蟲期全部不能結繭。