磺胺二甲嘧啶對稻田土壤微生物的中長期效應

徐佳迎，周金蓉，吳杰，王玨，程粟裕，趙鴿，蔣靜艷

（南京農業大學資源與環境科學學院，南京210095）

磺胺類藥物是使用最廣泛的獸用抗生素品種之一[1]。其進入動物體內并不能被動物體吸收代謝完全，約有50%～90%以母體化合物或其代謝產物的形式經由動物糞尿排出體外，再隨畜禽糞便的施用進入環境[2]。有報道指出豬糞中磺胺類藥物的含量為20～40 mg·kg-1[3]，Ji 等[4]也指出施用過豬糞的農田土壤中磺胺類藥物含量范圍可高達4.54～24.66 mg·kg-1。磺胺類藥物是廣譜抑菌抗生素，可抑制葉酸途徑中二氫蝶酸合成，進而抑制細菌的繁殖。因此，當磺胺類抗生素進入土壤后，土壤中的微生物種群數量和結構組成都會受到影響[5-6]。目前已有大量文獻報道了磺胺二甲嘧啶（SMZ）施入土壤后短期內對土壤微生物活性和群落多樣性有抑制作用，如刁曉平等[7]采用室內培養法，研究了10、100 mg·kg-1和500 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶培養24 h 和48 h 后對不同土壤微生物種群數量的影響，結果表明磺胺二甲嘧啶短期培養后對所測的4 種土壤中的細菌均具有抑制作用，且這種抑制作用隨濃度的降低而出現下降的趨勢。張敏等[8]采用Biolog 法，研究了磺胺二甲嘧啶對沼氣發酵過程中微生物群落的影響，結果表明在沼氣發酵第6 d，20、60 mg·kg-1和120 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶對微生物群落功能多樣性和物種豐富度均有抑制作用，且濃度越高抑制作用越顯著。磺胺類抗生素在土壤中的降解是一個先快后慢的過程，在光照條件下磺胺類抗生素在江西紅壤中降解半衰期為20～58.5 d，在太湖水稻土和東北黑土中降解半衰期為5.3～16.5 d，90%降解率所需時長均大于180 d[9]。目前關于磺胺二甲嘧啶對土壤微生物影響的研究多圍繞其輸入后的短期效應，缺乏其輸入后對土壤微生物中長期影響的研究，關于磺胺二甲嘧啶降解產物的研究也多集中在水體中，對其在土壤中降解產物的研究較為鮮見。因此，結合磺胺二甲嘧啶在土壤中降解半衰期，有必要開展其對土壤微生物中長期效應的研究。

本課題組前期工作表明在稻田試驗中輸入30 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶47 d 和61 d 后，磺胺二甲嘧啶對稻田N2O（由硝化或反硝化作用產生）排放仍具有顯著促進作用（P＜0.05），但是磺胺二甲嘧啶殘留率僅為1.8%～5.2%[10]。該階段磺胺二甲嘧啶在土壤中的降解轉化及其對土壤微生物群落結構的影響值得深入探索，故本文結合HPLC-MS 分析和Illumina Miseq測序兩種技術研究磺胺二甲嘧啶母體及其降解產物對土壤微生物的影響，以期深入了解磺胺二甲嘧啶輸入土壤后的中長期效應，為了解其環境生態風險提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

田間試驗位于江蘇省南京市江寧區典型稻麥輪作區（118°59′E，31°57′N），試驗田土壤有機碳含量為29.39 g·kg-1，全氮含量為1.93 g·kg-1，pH 為7.67，土壤容重為1.30 g·cm-3。供試抗生素為上海麥克林公司生產的磺胺二甲嘧啶試劑。供試豬糞為經堆置的從未接觸過任何抗生素的家豬排泄物，全氮含量為8.82 g·kg-1，有機質為752.03 g·kg-1。試驗處理設置為：以豬糞（M）為基肥，尿素為追肥，有無30 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶（M 和M+SMZ）和以復合肥（F）為基肥，尿素為追肥，有無30 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶（F 和F+SMZ）。本試驗供試水稻品種為南粳55 號，水稻于2017年6月4日播種，2017年11月11日收獲。4個處理施氮總量（以N 計）均為220 kg·hm-2，按基肥∶追肥=1∶1 比例撒施，磺胺二甲嘧啶隨基肥一次性施入，追肥時不再添加。基追肥時間分別為2017 年6 月4日和2017 年7 月29 日。試驗田采用微區設計，小區面積為3 m×2 m，每個處理設置3 個重復，隨機排列。各小區之間設有80 cm 寬、30 cm 高的田埂，田埂用塑料薄膜覆蓋，且每個小區都有各自獨立的灌排水系統，以防止水肥串流。整個水稻生育期N∶P2O5∶K2O施肥比例為2∶1∶1。豬糞處理不足的磷鉀以過磷酸鈣（P2O5，12%）和氯化鉀（K2O，60%）補充。除肥料外，試驗田按照當地常規措施進行水藥管理。采集磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d和61 d后的4個處理表層（0～20 cm）土壤樣品，用于磺胺二甲嘧啶及其降解產物殘留測定、DNA的提取和測序分析。

在田間試驗結果明確了降解產物為2-氨基-4，6-二甲基嘧啶（ADPD）和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺（AN）的基礎上，為了進一步明確磺胺二甲嘧啶輸入土壤47 d 和61 d 后是否是其降解產物在土壤中起主導作用，本文進行了室內模擬驗證培養試驗。處理設置同田間試驗，將1 mg·kg-1ADPD（上海麥克林生化科技有限公司，97%）分別與豬糞（M）或復合肥（F）（N，50 mg·kg-1干土）同步添加于土壤中（M+ADPD 和F+ADPD），同時做無ADPD 對照（M 和F），每個處理3 個重復，在恒溫恒濕（25 ℃、95%水分）條件下進行室內模擬培養。培養48 h后采集土樣，進行DNA 的提取和測序分析。因無4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺化學純品銷售，故未能進行此降解產物驗證試驗。

1.2 分析方法

1.2.1 磺胺二甲嘧啶殘留和降解產物提取測定

用HPLC（美國Agilent）進行磺胺二甲嘧啶殘留檢測。磺胺二甲嘧啶提取方法參考文獻[11]，HPLC參數為流動相：0.1%甲酸溶液∶乙腈=83∶17；紫外檢測器：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL；流速0.8 mL·min-1，色譜柱：C18柱。磺胺二甲嘧啶降解產物提取方法同磺胺二甲嘧啶提取方法[11]，利用HPLC-MS（美國Agilent，1200-6410B 三重串聯四極桿液質連用儀）進行降解產物鑒別。流動相：0.1%甲酸溶液∶乙腈=83∶17；紫外檢測器：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL；正離子模式（ESI+）；噴霧器壓力為30 psi（1 psi=6.895 kPa）；拉伸電壓：125 V；掃描范圍：m/z50～500。通過外標法利用HPLC-MS 對磺胺二甲嘧啶降解產物2-氨基-4，6-二甲基嘧啶進行定量分析，外標物為0.01 mg·mL-12-氨基-4，6-二甲基嘧啶標準溶液。由于沒有4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺標品，所以4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺濃度是其質譜中離子豐度與0.01 mg·mL-12-氨基-4，6-二甲基嘧啶離子豐度換算得到的相對值。

1.2.2 土樣DNA的提取與檢測

DNA的提取步驟根據E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒（OMEGA）操作，完成基因組DNA 抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。

1.2.3 PCR擴增和測序

以土樣提取的DNA 為模板，使用細菌通用引物341F 和806R 擴增樣品中16S rRNA 基因。PCR 擴增體系是20 μL：4 μL 5×FastPfu 緩沖液、2 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1）、0.8 μL Forward Primer（5 μmol·L-1）、0.8 μL Reverse Primer（5 μmol·L-1）、0.4 μL FastPfu 聚合酶、10 ng DNA 模板，補滅菌水至20μL。PCR 擴增程序為：95 ℃預變性5 min，27個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），最后72 ℃延伸10 min，每個樣本3 個重復。將同一樣本的PCR 產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠回收PCR 產物，用Tris_HCl 洗脫，最后再用2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluor?-ST 藍色熒光定量系統（Promega 公司）進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。之后構建Illumina PE250文庫，使用Illumina PE250平臺進行高通量測序，測序工作由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.2.4 數據處理

Illumina PE250 測序序列：根據barcode 得到所有樣品的有效序列，然后對reads的質量進行質控過濾，再根據PE reads 之間的overlap 關系，將成對的reads拼接成一條序列，最后按照barcode 和引物序列拆分得到每個樣本的優質序列，并在過程中根據正反barcode 和引物方向校正序列方向以及去除嵌合體。利用Usearch 平臺，根據97%相似性對非重復序列進行OTU 聚類，采用RDP classifier 貝葉斯算法對OTU 代表序列進行物種分類分析，比對采用Silva[12]數據庫。利用R 語言進行Alpha 多樣性指數分析，Origin 軟件進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 磺胺二甲嘧啶降解產物定性與定量

利用HPLC-MS對磺胺二甲嘧啶在土壤中的降解產物進行鑒定，全掃描模式下化合物的總離子流如圖1所示。與對照M或F處理對比，M+SMZ或F+SMZ處理在兩個采樣時間的m/z124 峰值和m/z215 峰值均有明顯增加。由此可知，磺胺二甲嘧啶在土壤中降解產生了m/z124 和m/z215 兩種物質。采用MS-MS 模式對這兩種降解產物的分子結構進行分析，結果與水溶液中磺胺二甲嘧啶降解產物的研究比較，得到這兩種降解產物的裂解途徑和分子結構（圖2）[13-14]。說明磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d和61 d后，均降解產生了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺[15-16]。定量分析結果（圖3）表明，磺胺二甲嘧啶含量隨輸入土壤時間的延長而逐漸降低，2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺含量則呈現先增后減趨勢，且2-氨基-4，6-二甲基嘧啶是磺胺二甲嘧啶的主要降解產物。

2.2 土壤微生物群落多樣性

2.2.1 Alpha多樣性

稀釋曲線是采用隨機抽樣的方法，以抽取到的序列數和它們所代表的OTU 數目來構建曲線，它可以用來比較各樣本間物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。由圖4 可知，當隨機抽取的序列數達到30 000條時，稀釋曲線增加趨勢均趨于平緩，并且樣本覆蓋度（Coverage）均在95%以上，說明樣品測序數據量足夠大，能夠有效反映樣品中絕大多數微生物物種的信息。

圖1 SMZ輸入稻田后47 d和61 d的總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram（TIC）of SMZ input into the rice fields after 47 d and 61 d

圖2 TIC圖中m/z 124和m/z 215二級質譜圖Figure 2 Mass spectra of the degradation products of m/z 124 and m/z 215 in TIC

基于OUT聚類分析結果，對OUT進行Alpha多樣性分析。表1 是各處理Alpha 多樣性指數，與同種肥源對照相比，除ADPD 處理Shannon 和ACE 指數有顯著差異（P＜0.05）外，其他處理OTU、Shannon 和ACE指數均差異不顯著（P＞0.05），表明無論基肥是豬糞還是復合肥，2-氨基-4，6-二甲基嘧啶對土壤微生物群落豐富度和多樣性均有顯著影響，而磺胺二甲嘧啶對土壤微生物群落豐富度和多樣性影響差異不顯著。

2.2.2 細菌群落結構組成

圖3 不同處理SMZ、ADPD和AN含量變化Figure 3 Variation of SMZ，ADPD and AN content in different treatments

圖5 是各處理在門水平上有顯著差異變化的優勢細菌（放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門）的平均相對豐度。磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d后M+SMZ 與M 處理比較，芽單胞菌門相對豐度顯著降低了0.81%（P＜0.05），表明該階段M+SMZ處理對芽單胞菌門有顯著抑制作用。F+SMZ與F處理比較，放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門相對豐度變化均無顯著差異（P＞0.05）。磺胺二甲嘧啶輸入稻田61 d后M+SMZ與M處理對比，放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門相對豐度也均表現出不同程度的增加，其中放線菌門和厚壁菌門顯著增加2.66%和0.71%（P＜0.05），表明此時M+SMZ 處理對放線菌門和厚壁菌門均有顯著促進作用。F+SMZ 與F 處理相比，4 個菌門相對豐度則均呈現出下降的趨勢，降幅為0.09%～1.95%，硝化螺旋菌門相對豐度降低達顯著水平（P＜0.05）。ADPD 培養驗證試驗結果與磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d 后的田間試驗結果一致，也表明了ADPD 與豬糞同步輸入土壤后對芽單胞菌門有顯著抑制作用（P＜0.05）。

圖4 不同處理稀釋曲線Figure 4 Dilution curves of different treatments

表1 不同處理Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index for different treatments

圖5 不同處理放線菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門和硝化螺旋菌門相對豐度Figure 5 Relative abundance of Actinobacteria，Gemmatimonadetes，Firmicutes and Nitrospirae of different treatments

圖6 是各處理在屬水平上有顯著差異變化的優勢細菌（Subgroup6_norank、芽單胞菌屬、熱脫硫桿菌屬和伯克氏菌屬）的平均相對豐度。磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d后M+SMZ和M處理比較，Subgroup6_norank菌屬相對豐度顯著增加0.54%（P＜0.05），芽單胞菌屬、熱脫硫桿菌屬和伯克氏菌屬相對豐度均有所下降，其中芽單胞菌屬顯著降低0.70%（P＜0.05），表明此時M+SMZ 處理對Subgroup6_norank菌屬有顯著促進作用，對芽單胞菌屬起顯著抑制作用。F+SMZ 和F處理比較，芽單胞菌屬和熱脫硫桿菌屬相對豐度增加0.13%和0.12%，Subgroup6_norank和伯克氏菌屬相對豐度則分別下降1.50%和0.04%，增加和降低均不顯著（P＞0.05）。磺胺二甲嘧啶輸入稻田61 d 后M+SMZ 與M 處理相比，伯克氏菌屬相對豐度極顯著增加0.25%（P＜0.01）。該時段F+SMZ與F處理相比，熱脫硫桿菌屬相對豐度顯著降低0.43%（P＜0.05），表明以豬糞或復合肥為基肥時，磺胺二甲嘧啶對土壤微生物菌屬的中長期效應不同。此外，ADPD 培養驗證試驗結果也證實了ADPD 與豬糞同步輸入土壤后對Subgroup6_norank有顯著促進作用（P＜0.05），與復合肥同步輸入土壤后與豬糞趨勢一致，但未達顯著作用水平（P＞0.05）。

圖6 不同處理Subgroup6_norank、芽單胞菌屬、熱脫硫桿菌屬和伯克氏菌屬的相對豐度Figure 6 Relative abundance of Subgroup6_norank，Gemmatimonadaceae，Thermodesulfovibrionia and Burkholderiaceae of different treatments

3 討論

3.1 磺胺二甲嘧啶降解轉化途徑

磺胺類抗生素在氧化過程中，其分子結構中的磺酰胺鍵容易發生斷裂生成小分子化合物[17]。在本研究中，磺胺二甲嘧啶磺酰胺鍵斷裂產生了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶，且與標準樣品進行比較得到了證實，這與水中活性氧作用下磺胺二甲嘧啶的降解產物一致，也與磺胺二甲嘧啶光解過程中的降解產物一致[18-19]。磺胺二甲嘧啶在水中化學降解和光降解得到的產物與土壤中生物降解的相同，說明磺胺二甲嘧啶的非生物降解和生物降解遵循一定的規律[20]。在本研究中，磺胺二甲嘧啶降解還產生了4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺，這與Gao 等[21]在紫外光作用下過硫酸鹽氧化磺胺二甲嘧啶的研究結果一致。磺胺二甲嘧啶分子上的苯氨基能夠轉化為苯氨基陽離子，苯胺基陽離子對位遭受分子間嘧啶氮親核作用而發生分子間重排，導致脫除，生成4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺[22-24]。由于缺少4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺標準樣品，所以本試驗未對其進行確切驗證和深入研究。磺胺二甲嘧啶另外一個重要的轉化途徑是其苯胺部分逐步氧化，生成N4-OH-SMZ、4-NO2-SMZ 和N-（4，6-二甲基嘧啶-2-基）苯磺酰胺等中間產物，這些中間產物可進一步降解，最終分解為二氧化碳和水[14-15，25]。目前本研究只鑒定到了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺兩種降解產物，磺胺二甲嘧啶其他降解產物還需進一步研究。

3.2 磺胺二甲嘧啶及其降解產物對土壤微生物的影響

磺胺類抗生素的化學結構類似于對氨基苯甲酸，能與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，阻斷細菌中二氫葉酸的合成，抑制以二氫葉酸為底物的四氫葉酸的合成，進而影響細胞中嘌呤和嘧啶的合成，抑制細菌的正常生長和繁殖[26]。表2 是牛糞（CM）和53.60 mg·kg-1磺胺二甲嘧啶單一和復合添加至T（[意大利]圖拉）和S（[意大利]薩薩里）兩種土壤中，短期培養7 d，期間土壤微生物多樣性的變化結果[27]。由此可知短期培養期間，磺胺二甲嘧啶對添加牛糞的T 土壤處理微生物活性和豐富度有促進作用，對未添加牛糞的T 土壤處理微生物活性和豐富度起先抑后促作用；在S 土壤中，磺胺二甲嘧啶對各處理微生物活性和豐富度均有抑制作用。這與本文磺胺二甲嘧啶對土壤微生物群落多樣性和豐富度的中長期效應結果不一致。究其原因，是在本研究中磺胺二甲嘧啶已經降低至較低水平，此時2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺等中間產物在土壤中起主要作用，中間產物結構與母體不同，不具備類似對氨基苯甲酸的化學結構，所以其對微生物的生態毒性要比母體低。Zessel等[28]研究表明磺胺二甲嘧啶光解過程中降解產物對細胞增殖的影響低于母體。García-Galán 等[29]利用單細胞綠藻檢測磺胺二甲嘧啶及其降解產物的毒性，結果證明磺胺二甲嘧啶的中間產物毒性均低于母體。因此，在本研究中磺胺二甲嘧啶及其降解產物對土壤細菌群落影響要小于初期磺胺二甲嘧啶對土壤微生物的影響。抗生素在土壤中的長期殘留還會誘導產生大量的抗生素耐藥微生物及抗性基因，進一步導致磺胺二甲嘧啶及其降解產物對土壤細菌群落的影響無顯著差異，Zhang等[30]研究表明四環素在土壤中長期積累能夠促進四環素抗性基因產生和傳播，Xi等[31]研究表明水產養殖場沉積泥中微生物群落對抗生素長期殘留能夠產生適應性。

本研究中，放線菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門（硝化細菌）、Subgroup6_norank和伯克氏菌屬均具有一定生物降解作用。Lan 等[32]最新研究指出Subgroup6_norank菌屬能夠將復雜的有機物發酵成為酸，Gu 等[33]研究指出厚壁菌門中大部分細菌能夠通過發酵作用將多種碳源降解轉化為乳酸、丙酮、丁醇和乙醇等小分子物質，蔣悅秋等[34]對農藥毒死蜱降解菌研究表明伯克氏菌屬CD5 和CD7 菌株均能高效降解土壤中的毒死蜱，吳凡等[35]的研究表明硝化細菌能夠有效促進土壤中碘普羅胺降解。這些具有降解作用的細菌相對豐度顯著增加，說明土壤微生物的功能性發生變化，這與磺胺二甲嘧啶在土壤中的降解轉化有著密切的聯系。而芽單胞菌門能夠將各種糖分子轉化為維生素，熱脫硫桿菌屬在土壤中起反硫化作用，兩者相對豐度顯著降低的原因還有待進一步研究。

本研究中，2-氨基-4，6-二甲基嘧啶對土壤微生物群落豐富度和多樣性均有顯著影響，而磺胺二甲嘧啶對土壤微生物群落豐富度和多樣性影響差異不顯著。降解產物2-氨基-4，6-二甲基嘧啶反而比母體磺胺二甲嘧啶對土壤微生物結構與功能的影響更大，其原因有待進一步研究。在磺胺二甲嘧啶輸入稻田47 d 后，M+SMZ 處理對芽單胞菌門有顯著抑制作用，對Subgroup6_norank菌屬有顯著促進作用，這與培養試驗中ADPD、豬糞同步輸入土壤后，對芽單胞菌門相對豐度有顯著抑制作用和對Subgroup6_norank菌屬相對豐度有顯著促進作用結果一致。此時磺胺二甲嘧啶基本已經降解為2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺等中間產物，其中2-氨基-4，6-二甲基嘧啶質譜信號最強，含量最高，且培養驗證試驗也進一步證實了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶在此階段對土壤微生物起主要影響作用。此外，M+SMZ 處理中的放線菌門、厚壁菌門和伯克氏菌屬相對豐度變化趨勢與M+ADPD 處理一致，F+SMZ 處理中的放線菌門、硝化螺旋菌門、芽單胞菌屬和熱脫硫桿菌屬相對豐度變化趨勢與F+ADPD 處理吻合，也說明了此時2-氨基-4，6-二甲基嘧啶作為磺胺二甲嘧啶的主要降解產物在土壤中對微生物起主要影響作用。而磺胺二甲嘧啶輸入稻田61 d 后，M+SMZ 處理對放線菌門和厚壁菌門有顯著促進作用，對伯克氏菌屬有極顯著促進作用，F+SMZ處理對熱脫硫桿菌屬有顯著抑制作用，各處理間其他細菌相對豐度變化趨勢也與ADPD 處理不一致。可能是因為2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺轉化為其他降解產物，其含量降低，新的降解產物在土壤中對微生物起主要作用。Ana等[18]研究表明2-氨基-4，6-二甲基嘧啶可以進一步羥基化為4，6-二甲基-2，5-二氫嘧啶-2，5-二醇。Fan 等[14]研究指出4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基）]苯胺能繼續氧化為亞硝基衍生物和羥基化亞硝基衍生物。Dong 等[13]研究表明磺胺二甲嘧啶中間降解產物會隨時間變化而變化。土壤中磺胺二甲嘧啶降解產物不同，其對土壤微生物的生態毒性也不同。肖華花[19]研究發現磺胺二甲嘧啶光解過程中母體與降解產物對明亮發光桿菌的毒性隨反應時間的變化而變化。魏子艷[36]研究發現抗生素對土壤微生物的影響隨染毒時間的延長而變化。因此，磺胺二甲嘧啶降解產物的變化及其對微生物的生態效應有待進一步研究。

表2 不同土壤牛糞和磺胺二甲嘧啶單一和復合處理培養7 d期間土壤微生物活性和豐富度變化[27]Table 2 Changes of soil microbial activity and richness during 7 d of single and combination treatment of cow manure and SMZ for different soils[27]

本文試驗結果還表明以豬糞和復合肥作基肥時，磺胺二甲嘧啶對土壤微生物菌屬的中長期效應不同。這可能是由于糞肥的添加增加了土壤中有機質含量，有機質中含有大量帶負電荷的官能團，這些官能團能夠吸附帶正電荷的獸用抗生素及其降解產物離子，或通過氫鍵和富電子基團的親核加成作用與獸用抗生素及其降解產物結合，進而影響土壤中獸用抗生素及其降解產物的生態毒性[37]。因此，需進一步探明不同施肥處理對獸用抗生素及其降解產物的影響機制，為降低其環境生態風險提供助力。

4 結論

無論基肥是豬糞還是復合肥，磺胺二甲嘧啶輸入土壤47 d 和61 d 后都降解產生了2-氨基-4，6-二甲基嘧啶和4-[2-亞氨基-4，6-二甲基嘧啶-1（2H）-基]苯胺，其中2-氨基-4，6-二甲基嘧啶為主要降解產物。在本研究中，磺胺二甲嘧啶對土壤微生物群落多樣性和豐富度變化均無顯著影響，但在微生物優勢群落組成上，磺胺二甲嘧啶與豬糞同步輸入土壤47 d后對芽單胞菌門和芽單胞菌屬有顯著抑制作用，對Subgroup6_norank菌屬有顯著促進作用，輸入土壤61 d 后對放線菌門和厚壁菌門有顯著促進作用，對伯克氏菌屬有極顯著促進作用，而磺胺二甲嘧啶與復合肥同步輸入土壤僅在61 d 后對熱脫硫桿菌屬有顯著抑制作用，原因在于該時段土壤中磺胺二甲嘧啶已降至較低水平，2-氨基-4，6-二甲基嘧啶等中間產物起主要作用。