非酒精性脂肪性肝炎無創診斷模型的構建

胡志軍，賀慶娟，陳松海，王春艷，付懿銘，陳國鳳，紀冬*

1解放軍總醫院第五醫學中心肝硬化診療二中心，北京 100039；2寶雞市中醫醫院脾胃肝病二科，陜西寶雞721000；3青島市第八人民醫院消化內科，山東青島 266100

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種無過量飲酒史、以肝臟實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為病理特征的臨床綜合征[1]，主要包括單純性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)[2]、非酒精性脂肪性肝纖維化和肝硬化[3]。44%～64%的NAFL患者在發病后3～7年進展為NASH，10%～25%的NASH患者在確診后8～14年進展為晚期肝纖維化或肝硬化(平均每7年進展至下一個肝纖維化階段)，2%～13%的晚期肝纖維化或肝硬化患者在確診后3～7年進展為肝癌[4]。目前肝穿刺活檢仍是NASH診斷的金標準，但其為有創操作，且受標本局限性及醫療條件等因素限制。近年來，無創診斷模型成為NASH診斷研究的熱點。本研究分析常規實驗室及臨床指標與肝穿刺活檢病理結果的相關性，構建預測NASH的無創診斷模型，以期為臨床提供簡單、準確評估NASH的手段。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年1月－2018年7月解放軍總醫院第五醫學中心(原解放軍第302醫院)經肝穿刺活檢病理診斷的NASH患者。NASH診斷標準符合中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組2010年制定的《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[5]。納入標準：①無飲酒史或飲酒折合乙醇量男性每周<140 g，女性每周<70 g；②肝活檢組織學改變符合脂肪性肝病的病理學診斷標準。排除標準：①酒精性肝病(ALD)、慢性丙型肝炎、自身免疫性肝病、肝豆狀核變性等可引起脂肪肝的特定肝??；②藥物(他莫昔芬、乙胺碘呋酮、丙戊酸鈉、甲氨蝶呤、糖皮質激素等)、全胃腸外營養、炎癥性腸病、甲狀腺功能減退癥、庫欣綜合征、β-脂蛋白缺乏癥以及部分與胰島素抵抗相關的綜合征等可導致脂肪肝的特殊情況；③病毒性肝炎、ALD、自身免疫性肝病、肝豆狀核變性、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥等其他類型肝病所致血清轉氨酶或γ-谷氨酰轉肽酶(GGT)增高；④肝臟惡性腫瘤、感染和膽道疾病；⑤正在服用或近期內服用過可導致肝臟酶譜升高的中藥及西藥者。共納入NASH患者111例，其中男70例，女41例，年齡12～70(36.7±15.2)歲；同時選取非NASH患者343例，其中男154例，女189例，年齡12～72(46.1±11.3)歲。隨機選擇364例(建模組，包括NASH患者85例、非NASH患者279例)用于建立無創診斷模型，其余90例(驗證組，包括NASH患者26例、非NASH患者64例)用于檢驗該模型的診斷效能。本研究通過解放軍總醫院第五醫學中心倫理委員會審批。

1.2 肝臟病理學檢測 由經驗豐富的醫師在B超引導下進行穿刺獲取肝組織?；顧z組織取出后用10%甲醛溶液固定，HE染色后由兩名經驗豐富的病理學醫師對組織進行半定量評分后按肝活檢病理活動度積分(NAS)進行診斷。

1.3 實驗室及臨床指標檢測 所有患者均測量身高、體重，計算體重指數(BMI)。實驗室及臨床指標包括血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、γ-谷氨酰轉肽酶(gamma glutamyl transferase，GGT)、尿素(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)、空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoproteins cholesterol，HDL-C)、鈣(calcium，Ca)、磷(phosphorus，P)、鎂(magnesium，Mg)、白細胞(white blood cells，WBC)、紅細胞(red blood cells，RBC)、血紅蛋白(hemoglobin，Hg)及血小板(platelet，PLT)。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。非正態分布的計量資料以M(Q1，Q3)表示，兩組間比較采用獨立樣本秩和檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。多因素分析采用前向逐步logistic回歸分析，應用受試者工作特征(ROC)曲線劃定界值并評價模型的診斷價值；ROC曲線下面積(area under curve，AUC)比較采用正態性Z檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料 兩組年齡、性別、BMI、血常規及生化指標比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，有可比性(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較Tab.1 General characteristics of patients in training group and validation group

2.2 NASH無創診斷模型構建 在建模組中，以NASH、非NASH為研究終點分組，將年齡、性別、血常規、生化及BMI等21項參數進行單因素分析，篩選出有明顯差異的8項指標(年齡、性別、GGT、鈣、磷、紅細胞、血小板、BMI)進行logistic回歸分析，并進行顯著性檢驗篩選納入模型的變量(納入：P<0.05；剔除：P<0.01)，最終確定與研究終點出現與否相關的獨立預測指標，根據獨立指標及其回歸系數建立預測研究終點的多元回歸方程，包含年齡、GGT、鈣、磷、紅細胞及BMI等6項指標，將該模型命名為NA-6(表2)。C=-20.242－0.033×年齡－0.011×GGT+3.493×鈣+1.771×磷+1.416×紅細胞+0.188×BMI。NA-6=eC/(1+eC)，C為判別NASH的多元回歸方程。

表2 建模組中NASH患者與非NASH患者臨床指標比較Tab.2 Comparison of clinical characteristics between NASH and non-NASH patients in training group

2.3 NASH無創診斷模型的診斷價值 在建模組中，NA-6的AUC為0.893，以敏感度+特異度最大為條件，其診斷NASH的截斷值為0.2，敏感度為84.7%，特異度為79.6%，陽性預測值度為57.1%，陰性預測值度為94.5%，準確度為81.6%。以該模型≤0.2為排除NASH的標準，可鑒別出79.6%的非NASH患者，陰性預測值可達94.5%。年齡、GGT、鈣、磷、紅細胞、BMI單獨診斷NASH的AUC與該模型比較，差異有統計學意義(P<0.001，表3)。

2.4 NASH無創診斷模型的重復性 將NA-6模型應用于驗證組，診斷NASH的AUC為0.829，兩組之間 診斷效能基本一致，表明該模型有可重復性(表4)。

表3 非酒精性脂肪性肝炎無創診斷模型與各獨立預測指標的診斷價值Tab.3 The diagnostic value of noninvasive diagnostic model and each of its independent prediction indicators

表4 非酒精性脂肪性肝炎無創診斷模型驗證結果Tab.4 Validation results of the noninvasive diagnostic model of NASH

3 討 論

NASH是由單純性脂肪肝進展所致，是肝硬化及肝癌發生發展的重要原因[6]。肝組織活檢目前仍是區分NAFL與NASH以及評估纖維化程度的有效手段，但肝組織活檢樣本僅占肝臟體積的1/5000，故不可避免地會產生抽樣誤差[7]，且肝組織活檢是一項侵入性技術，有0.3%的概率會出現嚴重并發癥，限制了其在臨床上的普遍應用。因此，研究者一直嘗試使用無創血清指標，包括血常規、肝酶、生物化學標志物、基因等評估NASH及其嚴重程度，但目前尚無任何單項指標能足夠準確判別NASH。近年來NASH無創診斷模型成為研究熱點，有學者針對NASH的脂肪變性及纖維化程度建立無創診斷模型或指數。SteatoTest用于預測肝臟脂肪變性時，具有無創、操作簡單和能進行定量評估的優勢[8]；脂肪肝指數(FLI)、NAFLD-肝臟脂肪分數(NAFLD-LFS)、三酰甘油-葡萄糖指數、內臟脂肪指數(VAI)和肝脂肪變性指數(HSI)等5項指標可用于診斷肝脂肪變性[9]。有研究將多種常規實驗室和臨床指標相結合，用于肝纖維化的預測評分診斷模型，包括BARD[10]、FIB-4[11]、NAFLD纖維化[12]和FibroMeter[13]等。馮鞏等[14]回顧性分析127例NAFLD患者，以30例健康者作為非NAFLD人群，發現影響最大的指標為ALT(β=0.358，P=0.001)，其次為BMI(β=0.258，P=0.012)，診斷方程的AUC為0.927，靈敏度為87.7%，特異度為90.0%，截斷值為277.7，具有較高的診斷效能。Eng等[15]收集了302例NAFLD兒童患者，經肝組織活檢病理診斷后分為NASH組與非NASH組，在逐步變量選擇后，以總膽固醇、腰圍百分位數、總膽紅素作為變量建立模型，其AUC為0.737，具有較高的辨別能力。龔先瓊等[16]將94例NAFLD患者根據肝組織活檢病理活動度積分(NAS)分為NASH組及非NASH組，兩組年齡、BMI、ALT、AST、UA差異有統計學意義(P<0.05)；Logistic回歸分析顯示，AST、UA水平與NAS有相關性(P<0.05)。

本研究以肝組織活檢病理診斷的NASH病例為基礎，構建以6項獨立指標(年齡、GGT、鈣、磷、紅細胞及BMI)為內容的NASH無創診斷模型(NA-6)，其預測NASH的AUC為0.893，根據截斷值0.2設定排除標準，可將79.6%的非NASH患者篩選出來，從而避免肝組織活檢，且陰性預測值可達94.5%，特異度為79.6%，敏感度為84.7%，準確度為81.6%，顯示出良好的診斷效能，且具有可重復性。

BMI可以預測NASH的發生，與肝臟脂肪變性程度相關[17-18]。丁玉平等[19]發現NAFLD與肥胖密切相關，且BMI的分布與NAFLD檢出率呈線性正相關，隨著BMI增高，NAFLD檢出率升高且脂變程度加重。內質網應激是導致NASH發病的主要因素之一，而血清鈣是內質網功能障礙和應激的主要誘因，鈣含量升高與NAFLD呈劑量依賴性相關，且相關研究表明，血清磷直接參與NAFLD的發病機制[20-21]。血小板可作為反映NASH的指標，隨著NASH進展，其活性明顯增加[22]，且血小板壓積升高是女性NAFLD發病的獨立預測因素[23]。全球成人NAFLD患病率為10%～40%，是發達國家兒童和青少年最常見的肝病，其脂肪變性程度與年齡呈負相關[24]。GGT在脂肪肝病變中作為一種保護性酶，在抗氧化和促進氧化型谷胱甘肽轉化成還原型谷胱甘肽的過程中起著重要作用[25]。酒精性肝病患者GGT明顯升高，NAFLD患者GGT多為輕度升高[26-28]。本研究結果顯示，NASH無創診斷模型的診斷效能明顯優于各個單項指標，表明將有價值的指標合理組合構建模型，可以提高判別能力。

本研究以無創指標構建的NASH無創診斷模型NA-6具有良好的診斷價值和穩定性，利用該模型可對NASH的診斷及嚴重程度做出敏感、準確的判斷，可在一定程度上替代肝穿刺活檢指導臨床治療及隨訪病情轉歸，具有一定的現實意義。為提高該模型的準確度，尚須在更多肝穿刺活檢患者中驗證其評價肝臟脂肪變性程度動態發展的能力，以及是否可單獨用于療效評估。