參附注射液調控大鼠心肌梗死模型microRNA-135a的表達機制

蘇天生　羅繼紅　盧靜　陳志斌 王志民　廖云海　林磊

【摘要】 目的：研究參附注射液對大鼠心肌梗死模型microRNA-135a的調控機制。方法：將60只健康SD大鼠隨機分為三組，每組20只。模型組和參附注射液組行結扎冠狀動脈左前降支（LAD）術建立心肌梗死模型，假手術組冠狀動脈不做結扎。模型組和假手術組予以0.9%氯化鈉注射液6.0 ml/（kg·d）腹腔注射，參附注射液組予以參附注射液6.0 ml/（kg·d）腹腔注射，連續給藥12周。比較三組大鼠心肌質量指數。采用Realtime RT-PCR方法檢測大鼠心肌microRNA-135a的表達。結果：參附注射液組和模型組大鼠全心質量指數及左心室重量指數均明顯高于假手術組，且模型組高于參附注射液組，差異有統計學意義（P<0.01）。與假手術組比較，模型組大鼠心肌microRNA-135a表達量上調，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，參附注射液組大鼠心肌microRNA-135a表達量下調，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：microRNA-135a在心肌梗死中可能發揮重要作用，參附注射液可能通過抑制microRNA-135a的上調，抑制心肌梗死大鼠心室重構，從而改善大鼠心功能。

【關鍵詞】 參附注射液 心肌梗死 microRNA-135a

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.16.001 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2020）16-000-03

Mechanism of Shenfu Injection Regulating the Expression of MicroRNA-135a in Rat Model of Myocardial Infarction/SU Tiansheng， LUO Jihong， LU Jing， CHEN Zhibin， WANG Zhimin， LIAO Yunhai， LIN Lei. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（16）： -3

[Abstract] Objective： To explore the regulation mechanism of Shenfu Injection on microRNA-135a in rat model of myocardial infarction. Method： A total of 60 healthy SD rats were randomly divided into three groups， with 20 rats in each group. The left anterior descending coronary artery （LAD） was ligated in model group and Shenfu Injection group to establish myocardial infarction model， while the coronary artery in sham operation group was not ligated. Model group and sham operation group were given 0.9% Sodium Chloride Injection 6.0 ml/ （kg·d） intraperitoneal injection， and Shenfu Injection group was given Shenfu Injection 6.0 ml/ （kg·d） intraperitoneal injection for 12 weeks. The myocardial mass index of the three groups was compared. The expression of microRNA-135a in rat myocardial was detected by Realtime RT-PCR. Result： The whole-heart mass index and left ventricular mass index of rats in Shenfu Injection group and model group were significantly higher than those in sham operation group， and the model group was significantly higher than that in Shenfu Injection group， the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with sham operation group， the expression level of microRNA-135a was up-regulated in the model group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with the model group， the expression level of microRNA-135a in rat myocardial was down-regulated in Shenfu Injection group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： MicroRNA-135a may play an important role in myocardial infarction. Shenfu Injection may improve the cardiac function of rats by inhibiting the up regulation of microRNA-135a and inhibiting the ventricular remodeling of rats with myocardial infarction.

[Key words] Shenfu Injection Myocardial infarction MicroRNA-135a

First-authors address： The Second Peoples Hospital Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350003， China

急性心肌梗死（AMI）是指由于冠狀動脈急性狹窄或閉塞，供血持續減少或終止，所產生的心肌嚴重缺血壞死。其主要病理生理機制是在冠狀動脈粥樣硬化的基礎上，由于某些機械原因（如高血壓或冠狀動脈痙攣等）誘發了易損斑塊的破裂和血栓形成，產生了急性冠狀動脈嚴重狹窄或完全閉塞的結果。急性心肌梗死在中老年多發，起病急，發病兇險，死亡率高，預后差。急性心肌梗死發展為缺血性心肌病、心衰的核心病理生理機制是心室重構，梗死心肌細胞發生凋亡，導致左心室大小、組織結構發生改變[1]。阻止或逆轉心室重構是延緩心力衰竭發生的重要手段。參附注射液有保護心肌、抗休克、改善心功能和微循環等作用，在缺血性心臟病中應用廣泛，但其對心肌microRNA-135a影響如何，還未見報道。本試驗通過結扎大鼠冠狀動脈左前降支（LAD）建立急性心肌梗死模型，研究參附注射液對心肌microRNA-135a的表達機制，為其臨床應用提供實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 儀器 電子天平、顯色劑（Thermo）、凝膠成像系統（BIO-RAD）、PCR儀（ABI）、PCR管（Axygen）、離心機（上海安亭科學儀器廠）、垂直電泳儀和轉膜系統（美國BIORAD公司）

1.1.2 試劑與藥物 逆轉錄試劑盒（Thermo）、miRNA qPCR Detection Kit（TIANGEN）、microRNA-135a引物（上海英濰捷基貿易有限公司）、75%乙醇、三氯甲烷、10%水合氯醛、參附注射液（SF，規格：10 ml/支，四川雅安三九藥業有限公司，批號：Z51020664，每毫升參附注射液含人參皂苷0.5 mg，烏頭堿0.1 mg）。

1.1.3 動物 清潔級SD大鼠60只，雌雄不限，體質量220～

290 g，8～12周齡，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供[動物合格證號：（閩檢證字）第2013A001號]。隨機分為三組：模型組（20只）、參附注射液組（20只）、假手術組（20只）。

1.2 方法

1.2.1 造模 建立大鼠急性心梗模型。通過結扎冠狀動脈左前降支造模。通過胸腔內注射10%水合氯醛進行麻醉后仰臥位固定，消毒鋪巾，胸骨左緣3、4肋間開胸，充分暴露心臟和冠狀動脈，將冠狀動脈左前降支分離，模型組和參附注射液組以4號絲線在冠狀動脈左前降支近端約2 mm處結扎，然后縫合關胸，假手術組只開胸分離冠脈左前降支，但不予結扎。造模成功后每只大鼠予以腹腔注射5 000 U青霉素以防感染，1次/d。

1.2.2 給藥 造模成功7 d后，模型組和假手術組：腹腔注射0.9%氯化鈉注射液6.0 ml/（kg·d）。參附注射液組：腹腔注射參附注射液6.0 ml/（kg·d），連續給藥12周。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 大鼠心肌質量指數測定 連續給藥12周后，處死大鼠取出心臟標本，PSB清洗，濾紙吸干，然后用電子天平稱全心質量和左心室質量。全心質量指數=全心質量/體質量，左心室質量指數=左心室質量/體質量。通過心肌質量指數測定可以間接評估心室重構嚴重程度。

1.3.2 實驗大鼠心肌組織microRNA-135a的表達水平 采用Realtime RT-PCR法分析，首先提取心肌組織RNA，取適量心肌組織在液氮中研磨，加三氯甲烷震蕩，然后用離心機12 000 r/min離心10 min后棄上清液，以75%乙醇洗滌RNA，再以12 000 r/min

離心10 min后棄上清液加適量DEPC水溶解RNA。RNA溶液稀釋后行濃度測定，用紫外分光光度計測定RNA樣品在260 nm和280 nm處的OD值，通過OD260/OD280比值鑒定RNA的質量和純度，選擇比值在1.8～2.0的樣品，計算其濃度。通過頸環結構的特異性引物反轉錄相應的microRNA，然后進行實時熒光定量PCR檢測，以雙標準曲線方法定量，分析各樣本的microRNA-135a濃度。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠左心室質量指數及全心質量指數比較

參附注射液組和模型組大鼠全心質量指數及左心室重量指數均明顯高于假手術組，且模型組高于參附注射液組，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。

2.2 三組大鼠心肌microRNA-135a的表達水平比較

與假手術組比較，模型組大鼠心肌microRNA-135a表達量上調，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，參附注射液組大鼠心肌microRNA-135a表達量下調，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

3 討論

急性心肌梗死在臨床上可通過癥狀體征、心電圖、心肌酶譜和肌鈣蛋白來診斷。因該病起病急，發病兇險，預后較差，故近年來對急性心梗預防越來越重視，用于診斷該病的檢測指標的研究也日新月異，其中microRNAs與心肌梗死診斷的相關性研究較為熱門[1-2]。microRNAs是一種非編碼的小RNA，在調節細胞增殖、分化、凋亡等多種生物學過程中起重要作用。研究表明，microRNAs在心肌肥厚、心力衰竭、心律失常等心血管疾病中發揮重要的調控作用[3-8]，但microRNAs在急性心肌梗死的作用通過調控哪些靶基因表達及其跨膜信號轉導仍未完全明確。有研究表明，microRNA-135a與心臟病關系密切，microRNA-135a參與大鼠心肌細胞凋亡的調控，通過介導各種靶基因調控心肌細胞凋亡通路，影響細胞存活與死亡[9]。

急性心肌梗死屬于中醫學“真心痛”范疇，真心痛是胸痹進一步發展的嚴重病證，其特點為劇烈而持久的胸骨后疼痛，伴心悸、水腫、肢冷、喘促、汗出、面色蒼白等癥狀，甚至危及生命。《靈樞·厥論》謂：“真心痛，手足青至節，心痛甚，旦發夕死，夕發旦死。”，其病因病機與年老體衰、陽氣不足、七情內傷、氣滯血瘀、痰濁化生、寒邪侵襲、血脈凝滯等因素有關。本虛是發病基礎。若心氣不足，運血無力，心脈瘀阻，心血虧虛，氣血運行不利，可見胸痛、心動悸，脈結代（心肌梗死、心律失常），或亡陽厥脫（心源性休克）。本病病位在心，其本在腎。故治療上可予以溫腎回陽救逆、益氣固脫。本研究使用的參附注射液是據明代薛己著作《正體類要》中的參附湯制成的中藥靜脈注射劑，由人參、附子兩味中藥的提取物混合而成，有回陽救逆益氣固脫的功效。

參附注射液對循環系統有顯著的作用，有較好的升壓、擴張血管、改善微循環、防治全身多器官缺血再灌注損傷的作用。目前參附注射液已廣泛應用于臨床急危重癥搶救，其對心肺復蘇后多器官的保護作用越來越受到重視。有研究表明，參附注射液可減輕心肺復蘇后大鼠心肌損傷和大鼠機體氧化應激狀態，并具有抑制心肌細胞凋亡、改善心功能的作用[10]。參附注射液可改善急性心肌梗死后缺血再灌注患者心臟功能，并能提高患者的后期康復率和生活質量[11-12]。胡丹丹等[13]通過參附注射液對膿毒癥大鼠心肌組織Bcl-2、Bax表達影響的研究，表明參附注射液可有效保護大鼠損傷再灌注心肌損傷，抑制心肌細胞凋亡，改善膿毒癥實驗大鼠心臟功能，故參附注射液保護急性心肌梗死患者心功能，可能與心肌細胞凋亡關系密切，而且有可能通過減少microRNA-135a表達進而抑制心肌細胞凋亡。然而參附注射液在對心肌microRNA的調控方面尚未明確。本研究發現參附注射液組大鼠心肌microRNA-135a表達量較模型組下調，差異有統計學意義（P<0.05）。參附注射液組大鼠全心質量指數及左心室重量指數均明顯較模型組低，差異有統計學意義（P<0.01）。故microRNA-135a在心肌梗死中可能發揮重要作用，參附注射液可能通過抑制microRNA-135a的上調，抑制心肌梗死大鼠心室重構，從而改善大鼠心功能。

綜上所述，參附注射液抑制microRNA-135a的表達水平是其治療急性心肌梗死重要分子機制之一。由于心肌梗死心室重構與多種microRNAs有關，本研究該不夠深入，參附注射液是否還通過其他microRNAs調控心肌梗死心室重構，還有待進一步的研究。

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（收稿日期：2020-02-13） （本文編輯：桑茹南）