痤瘡合劑對兔耳痤瘡模型外周血清炎性因子影響的實驗研究

于佳家　張小卿　吳景東　顧煒

[摘要]目的：本研究旨在觀察痤瘡合劑對兔耳痤瘡模型外周血清炎性因子表達的影響。方法：Kligman和Fulton法制備兔耳痤瘡模型，于兔耳內側涂抹煤焦油，時間2周，待造模成功后，痤瘡合劑組灌服痤瘡合劑（17.52g/kg/d）30d;陽性組灌服清熱暗瘡膠囊（0.12g/kg/d）30d;空白組與模型組灌服同等劑量生理鹽水。各組末次給藥后，24h內取靜脈血及局部皮膚組織病理活檢。ELISA法檢測各組家兔外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF水平，HE染色法觀察兔耳組織病理變化。結果：痤瘡合劑能有效減輕兔耳表皮層的厚度、膿腫、結節和兔耳毛囊開口收縮及擴張的程度，抑制毛囊漏斗內角質化物質的大量增殖，降低真皮炎癥細胞的增生和浸潤。除空白組外，各組血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α和GM-CSF表達水平在造模后均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;處理后，與模型組相比，痤瘡合劑組和陽性組血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α和GM-CSF表達水平均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。結論：痤瘡合劑能通過降低外周血清炎性因子濃度，調節免疫功能而改善兔耳痤瘡模型的病理表現。

[關鍵詞]痤瘡合劑;兔耳痤瘡模型;炎性因子;GM-CSF;白介素-3;腫瘤壞死因子α;白介素-13;白介素-4

[中圖分類號]R758.73+3? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）08-0027-04

Experimental Study of Inflammatory Cytokines Effect of Acne Mixture Decoction on Rabbit Ear Acne Models

YU Jia-jia1，ZHANG Xiao-qing1，WU Jing-dong2，GU Wei3

（1.The First Clinical Graduate School， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China;2.The President's Office， the 2nd Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenyang 110036，Liaoning，China;3.Department of Dermatology Clinic， the Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Shenyang 110043，Liaoning，China）

Abstract： Objective? To study the effect of Acne Mixture Decoction on the expression of inflammatory cytokines in peripheral blood of rabbit ear acne model. Methods? Rabbit ear acne model was prepared according to Kligman and Kwong method by applying coal tar to the internal surface of rabbit ears for 2 weeks. After confirming successful modeling， the mixture group was given Acne Mixture Decoction （17.52g/kg/d）， continuous dosing 30d. And the control group was given Clear Heat Acne Capsule （0.12g/kg/d）， continuous dosing 30d. The control group and the model group were given equal doses of saline solution respectively. Partial ear skin samples were biopsied within 24 hours after the last administration， and using ELISA to detect levels of IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in all groups.? Results? Acne Mixture Decoction can significantly reduce the abscess and nodules， reduce thickness of the rabbit ear epidermal and follicle funnel expansion， inhibit proliferation of keratinized compounds in follicle funnel， and reduce dermal inflammatory cell infiltration. Except the blank group， the expression levels of serum IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in each group were significantly increased after modeling， and the differences were statistically significant （P<0.01）. Compared with the model group， levels of IL-3， IL-4， IL-13， TNF-α and GM-CSF in the mixture group and the positive control group were significantly decreased （P<0.01）. Conclusion? Acne Mixture decoction can improve the pathological symptoms of rabbit ear acne model by reducing the concentration level of inflammatory cytokines in peripheral blood and regulating immune function.

Key words： acne mixture; rabbit ear acne model; inflammatory cytokine; GM-CSF; IL-3; TNF-α; IL-13; IL-4

痤瘡屬傳統中醫“粉刺”的治療范疇，青春期發病率高，患者會出現不同程度和癥狀的皮損性臨床表現，中國區患病率為39.3%[1]，歐洲為57.8%[2]。該病主要發生在皮脂豐盈的面部、胸背，輕則皮膚膿皰和丘疹，重則凹凸瘢痕，甚至引起面部皮損性毀容，給患者帶來極大的情志壓力負擔。現代西醫研究認為，炎癥反應、皮脂腺角質化異常、P.Acne（痤瘡丙酸桿菌）定植、皮脂分泌過多和情志心理因素等都是影響本病早期發病的機制，其中免疫功能異常是影響本病的重要病理學因素[3]。因此，本實驗以痤瘡合劑（遼寧中醫藥大學附屬醫院院內制劑）作為主要研究因素，以解癰散結，清上焦（肺）、中焦（胃）之濕熱為診治原則，觀察痤瘡合劑對兔耳痤瘡的病理學影響，探討該方劑調節炎癥介質在本病發病中的免疫級聯效應的作用。

1? 材料和方法

1.1 實驗動物：健康雄性新西蘭SPF級大白兔32只，年齡（11.81±0.7）周，體重（1.94±0.38）kg，沈陽滕華生物技術有限公司提供，許可證號：scxk（遼）2018-0002。于室內濕度35%～65%，室內溫度18℃～22℃的遼寧中醫藥大學實驗動物中心（SPF級）動物室飼養，許可證號：syxk（遼）2013-0009，晝夜交替12h，單籠飼養。本次實驗動物通過了遼寧中醫藥大學實驗動物倫理委員會倫理審查，審查編號2019CS（DW）-004-001。

1.2 藥品及試劑：痤瘡合劑（遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑），主要構成：夏枯草，防風，生地黃，枇杷葉，黃連等;清熱暗瘡膠囊（國藥準字Z20080425），江西普正制藥有限公司生產。煤焦油（批號：99891）;GM-CSF試劑盒（批號：F20061），上海西唐生物科技有限公司生產;IL-3試劑盒（批號：10701-H08H/R009），Sino Biological公司生產;TNF-α試劑盒（批號：SEA133Rb），武漢優爾生商貿有限公司生產;IL-13試劑盒（批號：ab119462），abcam公司生產;IL-4試劑盒（批號：SEA077Rb），武漢優爾生商貿有限公司生產。

1.3 主要儀器：酶標儀（Anthos2010型）;生物顯微鏡（CHA型）;脫水機（LEICA 300）;石蠟包埋機（EG1150）;切片機（LEICA RM2235）;恒溫水浴振蕩器（SHA-B）;離心機（PB300）;電熱恒溫培養箱（HH·B11·500型）。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組：新西蘭大耳兔購買后，喂養1周觀察其適應性，無死亡。分組方法應用隨機數字表：①空白組;②模型組;③痤瘡合劑組;④陽性組;每組8只。

1.4.2 痤瘡動物模型的建立及干預方案

1.4.2.1 環境適應期：新西蘭大耳兔適應性觀察飼養1周（每籠1只，室內控溫20℃～25℃，12h光照，12h黑暗）。以玉米、大豆、麥麩、牧草為主成分的顆粒狀飼料，配飼卷心菜和胡蘿卜喂養，不限飲水量及進食量。

1.4.2.2 動物造模：根據1989年美國皮膚病學會正式頒布的Kligman和Fulton造模法[4]制備兔耳模型，兔耳內側位于耳管近端約2cm×2cm位置，用醫用棉簽沾涂0.4～0.6ml煤焦油，每日1次，持續2周后，取兔耳組織病變部位，經組織學檢查造模成功后，再實施后續實驗。

1.4.2.3 干預方案：痤瘡合劑每日的臨床成人用量為58.48g，均分兩次口服，按人兔等效劑量法換算2.92g/kg/d。本實驗根據以往研究結果，藥物劑量確定為中劑量，按6倍的人兔等效劑量換算17.52g/kg/d，2次/d灌服。清熱暗瘡膠囊的臨床成人用量為2.5g，按人兔等效劑量法換算0.12g/kg/d，去膠囊，藥粉溶于生理鹽水，2次/d灌服，空白組及模型組等劑量灌服生理鹽水，連續30d。

1.4.2.4 血清采集及組織取材：10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后提取腹主動脈血，60min靜置，3 000r/m離心10min，提取血清2ml置于-80℃冰箱中凍存，ELISA法檢測外周血GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13和IL-4水平。家兔左耳耳管采血后，經耳緣靜脈注入20ml空氣栓塞處死，用1cm打孔器分別在家兔右耳耳管開口處取皮樣組織，10%多聚甲醛固定，置以石蠟包埋后制備病理切片。

1.5 指標檢測

1.5.1 兔耳組織病理：取固定的兔耳組織，流動水下完全沖洗，常規方法脫水、浸蠟、包埋，輪轉式切片機制備4μm超薄兔耳切片，脫蠟后行蘇木素-伊紅（HE）染色，Digital顯微鏡下靜置觀察兔耳組織病理學改變。

1.5.2 血清炎性因子含量檢測：采用ELISA檢測方法檢測各組家兔血清IL-4、IL-13、IL-3、GM-CSF及TNF-α水平變化。

1.6 統計學分析：實驗數據資料采用SPSS 22.0統計軟件包分析處理，各組計量資料采用單因素方差分析，結果以均數±標準差（x?±s）表示，P<0.05表示差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 造模情況：空白組家兔耳體薄、質地軟、毛細血管結構清晰，耳道開口區毛囊未見角栓并排列有序;模型組造模后14d，涂有煤焦油處的耳部出現不同程度紅腫，毛囊口有鼓起，且伴有多個增生性粉刺樣結節，皮損部位的表皮層較厚，可見大面積黑色粉刺狀角栓;痤瘡合劑組兔耳表皮層薄厚不一，結節和毛囊角栓溢出見少，角栓脫落部位留有坑狀的大毛囊，丘疹數量減少;陽性組表皮損傷修復程度與痤瘡合劑組療效接近。

2.2 兔耳病理改變：空白組兔耳皮膚各層結構完整，表皮層較薄，表皮與真皮邊界清晰，皮下組織無炎性細胞浸潤和小血管擴張等病理結構改變;模型組上皮出現特異性角化且明顯角化不全，顆粒層及棘細胞層組織增厚，真皮淺層可見小血管擴張及腫脹，炎性細胞浸潤，角化物質大量聚集毛囊漏斗處形成角化栓;痤瘡合劑組兔耳表皮角化程度明顯緩和，增厚的顆粒層及棘細胞層顯著變薄，真皮淺層炎癥細胞減少明顯，部分小血管輕微擴張，毛囊漏斗內聚集少量的角化物;陽性組毛囊擴張不明顯，炎性細胞浸潤顯著改善。見圖1～4。

2.3 血清炎性因子水平：處理后，空白組外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF濃度低于模型組，差異有統計學意義（P<0.01）;痤瘡合劑組和陽性組外周血清IL-3、IL-4、IL-13、TNF-α、GM-CSF濃度低于模型組，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖5。

3? 討論

痤瘡的病因病機早在《內經》中就已形成辨證論治的理論，認為痤瘡為上焦（肺經）、中焦（胃經）、下焦（大腸經）郁之熱邪所致。近年來許多中醫名家提出了濕熱、血瘀痰結、氣血凝塞等理論，并以燥濕、清熱、活血、散癰、化瘀、解毒為治療原則。筆者醫院通過觀察中藥治療痤瘡的臨床療效并結合現代醫學對痤瘡發病機制的認知，精研出痤瘡合劑，治療以解毒散癰，清瀉上焦和中焦濕熱為原則，用連翹和金銀花相須使用可清熱解毒、透邪、消癰散結，適用于肺熱所致肺風粉刺癥，黃芩清肺熱，消癰腫瘡毒，黃連瀉胃火治瘡毒，兩藥配伍清熱除濕解毒;枇杷葉苦寒，有清瀉肺胃之熱、利尿、止渴的功效;桑白皮既能助枇杷葉清肺熱，又兼利水，可使熱隨小便而去，與黃芩三藥搭配清泄肺胃積熱、降逆氣，藥理研究證明，黃芩、枇杷葉、桑白皮均有抑炎和抗炎作用[5]。沙參潤肺燥、養胃陰，防邪熱過盛而傷陰液;其藥理成分沙參多糖可抑制體液、細胞免疫，能調節和平衡免疫功能[5]。夏枯草散結泄熱消腫，抗病原微生物。牡蠣軟堅散結，配夏枯草可清火消癰散結，增強免疫。牛蒡子宣肺透疹，可治斑疹不透或癰腫瘡毒;防風升清燥濕，可祛隱疹固表;蟬蛻散肺經風熱而透疹;葛根發表透疹，以上四味搭配，上宣下透，外清內消，助疹毒于肌表散之，熱邪于腸道瀉之。熱入營血而久蘊化熱成毒，氣血郁而經脈失暢，以地黃配牡丹皮苦寒涼血化瘀;川芎性善行竄，通氣血;香附解郁疏肝止痛，氣行血暢，則熱毒火邪自解。此方臨床療效確切，治則基于“清瀉上中焦積熱，解毒涼血，活血化瘀散癰”的中醫理論，為進一步探討痤瘡合劑的免疫學機制奠定實驗基礎。

痤瘡疾病的具體發病機制受多種因素影響，歸納綜合病因有：①皮脂分泌亢進;②角質化異常;③炎癥反應;④痤瘡丙酸桿菌（P.Acne）定植。Melnik等[6-7]發現免疫功能異常是本病的另一個重要致病因素，且不排除多種細胞類型及介質誘導加劇刺激其炎癥反應。傳統觀點認為，微粉刺是痤瘡發病的亞臨床表現，在雄激素的病理刺激下，導致皮脂大量分泌，借此P.Acnes在毛囊內大量繁殖，進一步激發皮脂分泌和堆積，繼而促進毛囊皮脂腺過度角化，周而復始引起皮脂腺導管栓塞，最終由固有免疫系統誘導炎癥反應[8]。異常的皮脂分泌、腺體角化、毛囊栓塞、P.Acne增殖皆是影響和改變皮脂腺周圍環境的初始因素。Jeremy等在2003年研究發現炎癥反應至始至終貫穿整個P.Acnes發病過程，并揭示炎癥就是痤瘡疾病的刺激因素，經觀察患者非病變皮膚皮脂腺周圍有明顯的炎癥因子（CD4細胞、巨噬細胞、IL-1α水平均高于空白組），提示炎癥浸潤早于增生，炎癥介質是誘導P.Acnes發生發展的至關因素。

炎癥的基本特征是促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間相互交織的互聯集落，彼此間的極化博弈決定炎癥反應的趨向性。P.Acne通過多種促炎途徑直接啟動固有免疫系統，介導表皮主要細胞（角質形成細胞和皮脂腺細胞）激活TLR，并誘導TNF-α、GM-CSF和其他促炎細胞因子的產生，或以觸發炎性小體的激活途徑，導致殺傷細胞（粒細胞和巨噬細胞）趨化及聚集，誘導免疫炎癥反應[3]。GM-CSF是免疫調節因子的一種，可以刺激髓樣單核細胞（如DCs）的增殖、分化，參與炎癥和慢性炎癥反應[9]，且具有促進傷口愈合和組織修復功能[10]。IL-3與GM-CSF同屬β細胞因子家族，是激活固有免疫的中心介子，在宿主防御和炎癥反應中發揮重要功能[11]。IL-4是固有免疫細胞的生長因子，與IL-13共同作用刺激肥大細胞的生長和增殖，參與皮膚病炎性反應[12]。TNF-α被認為在各種免疫疾病和皮膚炎癥中啟動級聯激活，促進炎性介質釋放，造成免疫炎癥反應擴大，進而引起痤瘡的特異性免疫反應[13]。因此，本實驗采用ELISA檢測痤瘡模型外周血GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13及IL-4水平，探討炎性細胞因子在痤瘡發生發展過程中的免疫調控趨勢。

炎癥反應、免疫應答是參與和影響痤瘡病理變化的免疫功能機制，可導致機體免疫調節機能的失衡。痤瘡合劑能降低家兔外周血免疫因子GM-CSF、IL-3、TNF-α、IL-13及IL-4表達，抑制炎癥細胞浸潤，逃避免疫監視，從而阻斷炎癥級聯反應;從病理上可改善炎性皮損、結節、毛囊角栓及小血管充血，證明痤瘡合劑對兔耳痤瘡模型有較好的抗炎及抑炎作用。

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[收稿日期]2019-12-12

本文引用格式：于佳家，張小卿，吳景東，等.痤瘡合劑對兔耳痤瘡模型外周血清炎性因子影響的實驗研究[J].中國美容醫學，2020，29（8）：27-30.