生物修復對多環芳烴在土壤不同有機組分中分配特征的影響

姚倫芳

(1.貴州省環境與工程評估中心；2.貴州綠興清源環保有限責任公司，貴陽 550002)

有機污染物(如PAHs)在土壤環境中的遷移轉化和生物有效性主要取決于污染物與土壤不同組分之間的相互作用，其中黏土礦物和土壤有機質被認為是影響有機污染物在土壤環境中的行為的兩個最重要因素[1]。土壤環境中的有機質一般以游離態與結合態兩種形式存在，其中游離態有機質主要包括動植物殘體和微生物生物量，而結合態主要是有機礦質復合體，其中的有機質主要鎖定在土壤微團聚體內部或吸附在礦物表面[2]。比重分組法是研究土壤有機質常用的分組方法，Greenland等[3]首次采用該方法對土壤有機質進行了分組，將土壤中相對密度小于2.0 g·cm-3的組分定義為輕組(Light fraction, LF)，而相對密度大于2.0 g·cm-3的組分定義為重組(Heavy fraction, HF)。根據腐殖質與礦物結合的松緊程度，又可將重組有機質分為松結態、穩結態和緊結態三種形態[4]。其中，輕組有機質生物活性較高，與之結合的污染物生物可利用性較高；而重組有機質一般以有機礦質復合體的形態存在，生物活性相對較低，與之結合的污染物生物可利用性也較低[5]。在本課題組前期研究基礎上[6]，通過對比未經生物修復和經生物修復土壤不同有機組分中PAHs含量的變化情況，研究污染物在土壤不同組分的分布特征，對正確評估污染土壤PAHs生物有效性和環境風險具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

溴化鋅、無水焦磷酸鈉、氫氧化鈉、二氯甲烷、環己烷、無水硫酸鈉等均為分析純，購于國藥公司，上機用乙腈、層析硅膠為色譜純，購于美國Tedia公司。

1.2 供試土壤

在溫室條件下(25℃，12 h黑暗/光照交替)，采用盆栽實驗。實驗設置4個處理：(1)接種滅活菌劑(將木霉菌孢子懸液(接種量10%)接種在由麥麩和橘皮(1:1)制成的固體基質中，28 ℃條件下培養72 h，制成固體菌劑)，不種植紫花苜蓿(CK)；(2)接種滅活菌劑，種植紫花苜蓿(A)；(3)接種木霉菌菌劑，種植紫花苜蓿(TA)；(4)接種木霉菌、根瘤菌復合菌劑，種植紫花苜蓿(TRA)。每個處理設置4個重復。每盆裝供試土壤1.5 kg，菌劑150 g，加去離子水調節土壤水分至田間持水量的60%左右。選取催芽后的紫花苜蓿直接播種于裝好供試土壤的花盆中，10 d后間苗，每盆留苗10株。試驗期間土壤水分維持在田間持水量的60%左右，培養60 d后分別采集土壤和植物樣品。土壤樣品過2 mm篩后分成兩部分，一部分冷凍干燥，用于PAHs的提取測定，另一部分4℃冷藏，用于土壤微生物活性的測定。

本研究供試土壤采用盆栽實驗土壤，選取其中種植紫花苜蓿并接種木霉菌-根瘤菌復合菌劑處理的土壤(樣品編號：BS，樣品數：4)和無植物種植和微生物接種處理的土壤(樣品編號：CK，樣品數：4)進行分析。

1.3 分析測試方法

1.3.1 土壤不同有機組分的分離

稱取30 g凍干土樣(<2 mm)置于200 mL特氟龍離心管中，加入100 mL ZnBr2(比重為1.8 g·cm-3)溶液，將離心管置于搖床振蕩60 min，靜置分層，然后2500 rpm離心10 min，將懸浮固體用事先恒重的Whatman 1#濾紙過濾，并用去離子水沖洗干凈。離心管中剩下的土壤再用100 mL ZnBr2重復分離一次。將兩次得到的固體合并、凍干、稱重，得到輕組(LF)。離心管中余下的土壤用去離子水多次沖洗，去除殘留ZnBr2，凍干、稱重，最終得到重組(HF)。第一步得到的重組再分離得到松結態(H1)、穩結態(H2)和緊結態(H3)。將10 g重組土壤置于200 mL特氟龍離心管中，加入120 mL 0.1 mol·L-1NaOH溶液，25℃、200 rpm振蕩過夜，12 000 rpm離心15 min，將上層懸浮固體轉移至棕色玻璃瓶中，重復提取4～5次，直至溶液澄清，合并提取物，得到H1。離心管中剩余土壤加入100 mL 0.1 mol·L-1NaOH+0.1 mol·L-1Na4P2O7混合溶液，方法同上，重復3～4次操作，直至溶液澄清，合并提取物，得到H2；殘留在剩余土壤中的有機質則為H3。離心管中剩余的土壤用去離子水沖洗至溶液pH大約為7，凍干備用。

1.3.2 不同土壤組分中多環芳烴的提取及檢測

HF、LF、H3中PAHs使用索氏提取法提取，稱取2.0 g凍干土樣與2.0 g無水硫酸鈉混合均勻置于索氏提取管中，向茄形瓶中加入二氯甲烷70 mL，提取24 h，提取后樣品于旋轉蒸發儀濃縮至干(36℃)，然后向茄形瓶中加入2.0 mL環己烷溶解瓶中物質，取0.5 mL溶液過硅膠柱，用正己烷和二氯甲烷混合液(v/v，1∶1)洗脫，棄去起初的 1.0 mL洗脫液，收集2 mL洗脫液于刻度試管中，用高純氮氣吹干，加 2.0 mL乙腈溶解，使用HPLC測定。H1、H2溶液分別與50 mL二氯甲烷混合置于500 mL棕色玻璃瓶中，25℃、200 rpm振蕩24 h，靜置分層，吸取20 mL有機相置于100 mL茄形瓶中，采用旋轉蒸發儀濃縮至干(36℃)，然后向茄形瓶中加入 2.0 mL環己烷溶解瓶中物質，取0.5 mL溶液過硅膠柱，用正己烷和二氯甲烷混合液(v/v，1:1)洗脫，棄去起初的1.0 mL洗脫液，收集2 mL洗脫液于刻度試管中，用高純氮氣吹干，加 2.0 mL乙腈溶解，使用HPLC測定。

HPLC為日本島津Class-vp高效液相色譜分析系統，配熒光檢測器RF-10AXL,柱溫箱OT-10ASVP柱溫30 ℃，二元體鍍泵LC-10AT，色譜分離柱為美國Varian公司的ChromSpher 5 PAH(VPODS150_4.6mm I. D．，particlesize 5 mm，Shimadzu)，流動相為乙腈/水(65:35)，流速為1.5 mL·min-1，進樣量20 μL，梯度洗脫程序為：乙腈的初始體積分數為80%，終點體積分數為100%，洗脫時間20 min。

土壤PAHs總量回收率按輕組和重組中PAHs含量以及它們質量比計算得出原土中PAHs總量與原土中實測的PAHs總量百分比。重組中PAHs總量回收率按松結態、穩結態和緊結態中PAHs含量以及它們質量比計算得出重組中PAHs總量與重組中實測的PAHs總量百分比。

1.3.3 數據統計分析

本研究中所有數據處理使用Office Excel 2007進行，圖形采用Origin 8.0制作完成。

2 結果與討論

2.1 土壤分組的質量回收率和多環芳烴回收率

土樣BS、CK進行輕組和重組分離之后，其質量回收率分別為87.21%、90.35%(表1)，表明分組過程中土壤損失量較少。BS、CK中PAHs總量回收率分別為100.64%、103.74%；重組在進行松結態、穩結態和緊結態分組之后，PAHs總量回收率分別為106.16%、124.74%(表2)?？梢钥闯?，在進行土壤分組之后，PAHs的回收率均高于100%，這可能是分組之后增加了土壤顆粒與提取溶劑的接觸面積，很多鎖定在土壤中的PAHs在原土中未被提取出，而在分組之后被提取出[2]。其他研究也表明，一些土樣在粒徑分組和有機組分分組之后組分中PAHs的含量總和也高于原土中PAHs的含量[7-8]，另外土壤的基質效應也是多環芳烴回收率的影響因素[9]。

表1 土壤分組的質量回收率

表2 土壤分組的PAHs回收率

2.2 多環芳烴在土壤輕組和重組中的分配

圖1顯示了兩種土壤輕組和重組中PAHs含量，CK輕組中總PAHs含量為143885 μg·kg-1，重組中總PAHs含量為2643 μg·kg-1；而BS輕組中總PAHs含量為58886 μg·kg-1，重組中總PAHs含量為2559 μg·kg-1。輕組中PAHs 的含量遠遠超過重組中PAHs的含量，這是因為有機質是土壤中PAHs的主要吸附劑，而輕組有機質的含量遠遠高于重組，因而對PAHs的吸附量也高于重組[2]。圖2是輕組和重組中PAHs總量占原土中PAHs總量的相對百分比，CK輕組中PAHs總量占原土中PAHs總量百分比為69%，而輕組重量只占原土重量的4%；BS輕組中PAHs總量占原土中PAHs總量百分比為63%，而輕組重量只占原土重量的7%。另外，可以看出，經不同處理的土壤輕組含量和其輕組中PAHs含量發生了一定的變化，特別是后者，相較于CK而言，BS輕組中PAHs含量降低了59%，但是重組中PAHs含量的變化則不大，僅僅降低了3%，這說明土壤輕組中的PAHs生物可利用性較高，在對污染土壤進行生物修復時，其去除的污染物主要集中在土壤輕組有機質中，而存在于重組中的PAHs由于其生物活性低，大多難以生物利用，另一方面這部分的污染物環境風險也較低。研究表明，輕組有機質被土壤礦物吸附較松，主要游離于土壤溶液中，與之結合的污染物的有效性較高，更容易被生物利用[6]。

圖1 供試土樣輕組(LF)和重組(HF)中PAHs含量

圖2 輕組(LF)和重組(HF)PAHs含量占原土PAHs總量的百分比

2.3 重組多環芳烴在結合態腐殖質中的分配

圖3顯示了重組PAHs在結合態腐殖質中的分配情況，可以看出，BS、CK重組中PAHs主要分布在緊結態腐殖質組分中，分別占重組中PAHs總量的97.63 %、97.59%。穩結態腐殖質和松結態腐殖質結合的PAHs占重組中PAHs總量的百分比較小，CK中分別為0.95%、1.12%, BS中分別為1.16%、1.15%。根據不同結合態腐殖質與礦物結合的松緊程度，可以推斷出不同結合態腐殖質的生物有效性程度大小順序為松結態>穩結態>緊結態，那么不同結合態腐殖質結合的PAHs生物有效性程度的大小也應為松結態-PAHs>穩結態-PAHs>緊結態-PAHs。從這種角度看，PAHs污染土壤的環境風險主要在于與輕組有機質結合的PAHs，如果能夠從污染土壤中分離出輕組，那么剩余重組結合的PAHs絕大部分生物有效性較低，環境風險也就相對較小。

圖3 松結態(H1)、穩結態(H2)和緊結態(H3)PAHs總量占重組PAHs總量的百分比

3 結論

本次研究結果表明，生物修復土壤和對照土壤中輕組含量所占比例很小，分別只有7%和4%，但它結合的PAHs量比例很大，分別達到土壤中PAHs總量的63%和69%；重組中PAHs的含量主要分布在緊結態腐殖質中，分別占重組PAHs總量的97.59%、97.63%。PAHs在土壤中的分布，主要集中在輕組組分中，其活性較大，容易被生物所利用，而重組組分中的PAHs由于結合緊密，活性小，難以被生物利用；生物修復對PAHs污染土壤有較好的修復效果，但不會對PAHs在土壤不同有機組分中的分布產生較大影響。從土壤中PAHs在不同有機質組分中的分配來看，PAHs污染土壤的環境風險可能主要在于和輕組有機質結合的PAHs。