液相色譜-原子熒光法測定化妝品中硫柳汞和苯基汞

焦旭靜 馮 婷 裴曉華 薛辰全 董應尚

(1.北京吉天儀器有限公司，北京 100015；2.山東省荷澤生態環境檢測中心，荷澤 274000)

1 前言

硫柳汞和苯基汞是一類含汞的有機化合物，長期以來一直做為防腐劑被廣泛應用于眼科制劑和生物疫苗。硫柳汞的代謝或降解產物為乙基汞和水楊酸鈉，其作用機制為汞離子與菌體中酶蛋白的-SH(巰基)結合而使酶失去活性[1]從而抑制細菌生長；苯基汞具有抑制霉菌的作用。汞化合物會破壞表皮層的酵素活動,使黑色素無法形成，具有一定的美白功效，導致一些不法商人將汞類化合物違法添加至化妝品中。雖然硫柳汞和苯基汞具有抑菌、美白的作用，但是它們存在一定的毒性，在使用時容易通過皮膚等吸收到體內，并且在體內具有蓄積性，可能會引起中毒，引發神經性疾病[2]。《GB 7916-1987化妝品衛生標準》中對化妝品中硫柳汞含量和范圍做了相關規定，用量不超過0.007%(汞計)，僅用于眼部化妝品和眼部卸妝品[3]。

目前，針對化妝品中硫柳汞和苯基汞的檢測方法很多，常見的液相色譜法[4]、原子吸收分光光度法分光光度法[5]、紫外分光光度法[6]、有高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法[7]和毛細管電泳法[8]等。本實驗參考2019年06月04日發布的《GB/T 37649-2019 化妝品中硫柳汞和苯基汞的測定 高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法》[9]中樣品預處理方法，建立了用液相色譜進行分離，原子熒光光譜儀進行測定的化妝品中硫柳汞和苯基汞的方法，該方法檢出限低，分析速度快，精密度好，儀器性價比高，適用于化妝品中硫柳汞和苯基汞的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SA50-Kylin S18液相色譜-原子熒光聯用儀(北京吉天儀器有限公司)；KQ-300DE臺式數控超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設備有限公司)；3-18R冷凍離心機(恒諾儀器)。

硫柳汞標準品(純度96%，Dr.Ehrenstorfer)；苯基汞標準品(純度91%，Dr.Ehrenstorfer)。

鹽酸(優級純)；氫氧化鉀(分析純)；硼氫化鉀(優級純)；甲醇(色譜純)；L-半胱氨酸(優級純)；乙酸銨(優級純)；實驗用水均為實驗室超純水。

2.2 儀器工作條件

液相色譜條件：色譜柱(Agela Venusil MP C18 4.6*150mm，5μm)；保護柱(Agela C18保護柱4.6*10mm)；柱溫箱30℃；洗脫方式：梯度洗脫(詳見表1)；流動相A：甲醇，流動相B：乙酸銨溶液(60mmol/L乙酸銨+0.1%L-半胱氨酸)；流速為1mL/min；進樣量為100μL。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

原子熒光條件：負高壓：290V；Hg燈燈電流(40mA)；載氣：300mL/min；屏蔽氣：500mL/min；爐高：12mm；蠕動泵轉速：65r/min；載流：5%HCl；還原劑：1.5%KBH4+0.5%NaOH。

2.3 標準溶液的配制

標準儲備液配制：準確稱取5mg硫柳汞標準品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制得硫柳汞標準儲備液 (500mg/L)；準確稱取5mg苯基汞標準品于100mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制得苯基汞標準儲備液(50mg/L)。

標準中間液配制：分別準確移取0.1mL硫柳汞標準溶液 (50mg/L)和0.25mL苯基汞標準溶液 (500mg/L)于10mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，制得混合標準中間液(硫柳汞500μg/L，苯基汞12.5mg/L)；儲存在0～4℃冰箱備用。

標準工作液配制：準確移取0.050mL、0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL混合中間液(硫柳汞500μg/L，苯基汞12.5mg/L)分別加入到10mL容量瓶中，分別加入3mL甲醇，用乙酸銨溶液定容至刻度，制得一系列標準工作溶液(硫柳汞濃度分別為2.5μg/L、5.0μg/L、12.5μg/L、25.0μg/L、50.0μg/L ；苯基汞濃度分別為62.5μg/L、125.0μg/L、312.5μg/L、625.0μg/L、1250μg/L )。

2.4 樣品處理

稱取0.2g樣品于15mL刻度離心管中，加入4.5mL甲醇，超聲提取30min后，用乙酸銨溶液定容至15mL，混合均勻，置于8000r/min高速離心機上離心15min，取上清液經0.45μm過濾，濾液進行上機檢測，同時做樣品空白。

3 結果與討論

3.1 色譜條件的優化

流動相的條件對汞化合物的分離效果和靈敏度起到了關鍵性的作用，考察洗脫硫柳汞和苯基汞時甲醇的比例為10%、20%、30%、40%和50%時對分離度和靈敏度的影響，隨著甲醇比例的升高，硫柳汞和苯基汞的分離度逐漸減小，甲醇比例為50%時分離度為2.3，甲醇比例為30%時硫柳汞的靈敏度最高，甲醇比例為50%時苯基汞的靈敏度最高，為了兼顧分離度和靈敏度，最終選擇甲醇比例為50%，可有效的洗脫硫柳汞和苯基汞。

3.2 原子熒光光譜條件的優化

本實驗考察了KBH4濃度為1%、1.5%、2%、3%和4%(m/V)對硫柳汞和苯基汞熒光強度的影響。如圖1所示，當濃度為1.5%時硫柳汞和苯基汞具有最高的熒光強度，繼續提高KBH4濃度，硫柳汞和苯基汞的熒光強度反而有不同程度的下降，故本實驗選擇KBH4溶液的濃度為1.5%(m/V)。

3.3 樣品前處理條件的選擇

本實驗中化妝品試樣處理選用10mL甲醇溶解樣品，超聲提取后用乙酸銨溶液定容至15mL，本實驗考察了加入4.5mL、7.5mL和10mL甲醇溶解樣品，對峰型及加標回收率的影響。實驗結果顯示，加入7.5mL和10mL甲醇溶解樣品時，硫柳汞和苯基汞的峰展寬，硫柳汞的峰有毛刺，且加標回收率均偏低，加入4.5mL甲醇溶解樣品時，硫柳汞和苯基汞峰型最好，加標回收率高，故本實驗選用4.5mL甲醇溶解樣品，實驗過程中，標準工作液中的甲醇比例也需與試樣中的甲醇比例一致，避免產生溶劑效應。

3.4 方法學考察

3.4.1方法重復性

配制混合標準溶液(硫柳汞25μg/L，苯基汞625μg/L)進樣100μL, 連續進樣7針，以保留時間來衡量定性重復性，以峰面積來衡量定量重復性，詳細結果見表2，保留時間相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為0.30%～0.33%，峰面積相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為4.22%～4.96%，表明儀器具有良好的重復性。

表2 硫柳汞和苯基汞的儀器方法重復性(n=7)

3.4.2方法檢出限、定量限及線性

將硫柳汞和苯基汞系列混合工作液進行測定，以峰面積為縱坐標，相應的標液濃度(μg/L)為橫坐標，進行線性回歸計算，得到線性方程和相關系數；以信噪比S/N=3 確定檢出限(limit of detection，LOD)。實驗結果如表3所示，硫柳汞在2.5μg/L～50μg/L和苯基汞在62.5μg/L ～1250μg/L的范圍內線性相關性較好，線性相關系數(r)大于0.999，硫柳汞檢出限為0.060μg/L，苯基汞檢出限為0.23μg/L，色譜圖見圖2。

表3 硫柳汞和苯基汞的保留時間、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

圖2 硫柳汞和苯基汞色譜圖

3.4.3方法的回收率

選取化妝水、卸妝油、眼霜、乳液和珍珠霜5種樣品作為實驗樣品，測樣品中硫柳汞和苯基汞的本底值，并分別對樣品進行3個濃度的加標回收實驗，每個濃度6個平行實驗，結果表明：硫柳汞的加標回收率為84.7%～101.7%，苯基汞的加標回收率為84.1%～103.9%，該方法具有良好的準確性。

3.5 實際樣品的測定

應用本研究所建立的方法，對市售的5種化妝品(化妝水、卸妝油、眼霜、乳液和珍珠霜)進行檢測，檢測結果發現，樣品中硫柳汞和苯基汞均為未檢出，詳細結果見表4。

表4 樣品中硫柳汞和苯基汞的本底值及加標回收率

4 結論

建立了液相色譜-原子熒光光譜聯用技術檢測化妝品中硫柳汞和苯基汞的方法，樣品采用甲醇超聲提取的方式，采用甲醇和乙酸銨溶液(0.06mol/L乙酸銨+0.1%L-半胱氨酸)作為流動相進行梯度洗脫，經C18(4.6*150mm，5μm)柱分離后經原子熒光測定，11min內可實現硫柳汞和苯基汞的分析測試。硫柳汞和苯基汞標準曲線線性相關系數(r)均大于0.999，硫柳汞的檢出限為0.060μg/L，苯基汞的檢出限為0.23μg/L(S/N=3)，硫柳汞和苯基汞的回收率在84.1%～103.9%之間。實驗所建立的方法與國標《GB/T 37649-2019 化妝品中硫柳汞和苯基汞的測定 高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法》對比，分析時間短，靈敏度高，檢出限低，可對化妝品中硫柳汞和苯基汞進行更快速準確的測定，對化妝品安全風險監測具有重要意義。