沉默USP9X對肝癌HepG2細(xì)胞周期和自噬的作用機(jī)制

劉曉崗 沈預(yù)程 劉春桂 吉浩明

去泛素化酶USP9X(ubiquitin-specific protease 9X，USP9X)是泛素特異性蛋白酶家族(ubiquitin-specific protease, USP)的主要成員，可通過去泛素化靶向蛋白廣泛參與細(xì)胞多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞凋亡以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[1-2]。已有研究揭示USP9X與宮頸癌、膀胱癌等多個系統(tǒng)的腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。而在肝癌的研究中，USP9X基因下調(diào)可通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制肝癌的發(fā)展[5]。但由于肝癌的病理活動較為復(fù)雜，USP9X基因?qū)Ω伟┘?xì)胞的調(diào)控應(yīng)需更全面深入的研究。本研究采用siRNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)對肝癌HepG2細(xì)胞株的USP9X沉默表達(dá)，進(jìn)一步探討USP9X基因沉默對肝癌細(xì)胞的增殖和自噬的影響，為更全面地揭示沉默USP9X對肝癌細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制。

資料與方法

一、材料與試劑

人肝癌HepG2細(xì)胞株購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基購買自美國Gibco公司。胎牛血清購買自德國PAN公司。MTT試劑盒、胰蛋白酶、BCA蛋白測定試劑盒、ECL發(fā)光液以及二抗均購買自上海碧云天生物公司。兔源抗USP9X、LC3-II、Beclin-1以及β-actin抗體均購買自武漢三鷹生物公司。脂質(zhì)體LipofectaminTM 2000的試劑盒購買自美國Invitrogen公司。質(zhì)粒DNA純化試劑盒購買自美國TIANGEN公司。合成siRNA交由上海吉瑪生物公司。

二、試驗(yàn)方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將凍存于-80℃冰箱中的肝癌HepG2細(xì)胞復(fù)蘇后，接種在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，2～3 d進(jìn)行換液，置于37℃的細(xì)胞孵育中。待細(xì)胞生長至80%以上，采取0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。本研究根據(jù)是否沉默USP9X處理細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)分為：(1)NC組:將陰性對照鏈siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(2)siRNA組：將編碼USP9X的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞，用于蛋白免疫印跡檢測和流式細(xì)胞術(shù)檢測。

(二)沉默USP9X質(zhì)粒的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)GenBank中USP9X的基因序列，使用小干擾RNA設(shè)計(jì)軟件，USP9X的siRNA的正向序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。而陰性對照鏈的正向序列為5′-AGAAAUCGCUGGUAUAAA-UUUTT-3′，反向序列則為5′-AAAUUUAUACCAGCGAUU UCUTT-3′。USP9X的siRNA合成交由上海吉瑪生物公司完成。

(三)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 本研究設(shè)立對照組(Control)和轉(zhuǎn)染組(siRNA)，對照組采用陰性對照鏈的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染組再用Efp的siRNA干擾質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時每組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔，細(xì)胞鋪滿孔內(nèi)80%以上后采用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染首先采用無血清DMEM培養(yǎng)基6 h，然后再將培養(yǎng)基換為10%胎牛血清后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其余過程均按照說明書指示進(jìn)行。

(四)MTT試劑盒檢測細(xì)胞增殖能力 將HepG2細(xì)胞以密度5103個/孔接種在96孔板中，待細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA的時間為0、24、48和72 h時，將細(xì)胞依次進(jìn)行一下處理：洗滌3次、每孔加入100 μL培養(yǎng)基、再加入10 μL MTT溶液、將96孔板置于細(xì)胞孵育箱孵育2 h、棄上清液、最后加入DMSO溶液孵育10 min，將細(xì)胞置于酶標(biāo)儀中檢測吸光度，最終換算為細(xì)胞的增殖率

(五)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 將HepG2細(xì)胞以1106個/孔接種在6孔板中，待細(xì)胞生長至80%以上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用干擾siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h。首先洗滌細(xì)胞、采用胰蛋白酶消化重懸細(xì)胞、離心、棄上清，將此步驟重復(fù)2次后，在加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇固定、將細(xì)胞置于4℃冰箱過夜。次日清晨采用RNA酶處理細(xì)胞、采用碘化丙啶處理細(xì)胞、置于流式細(xì)胞儀下檢測細(xì)胞周期分布。

(六)Western blot檢測USP9X、IL3-II以及Beclin1蛋白的表達(dá) 細(xì)胞分組處理步驟同前，首先加入蛋白裂解液后提取各組細(xì)胞的總蛋白，嚴(yán)格按照BCA說明書檢測蛋白濃度，再將待測蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、5%牛奶封閉2 h后，采用USP9X、IL3-II以及Beclin1一抗4℃孵育蛋白條帶。次日將條帶洗滌后，再將條帶浸沒在二抗中室溫孵育，最終避光加入ECL發(fā)光液記錄分析相關(guān)蛋白的表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，各組的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、沉默USP9X顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖率

圖1結(jié)果揭示，肝癌HepG2細(xì)胞株的siRNA組中USP9X蛋白表達(dá)為0.44 ± 0.15，明顯低于NC組的1.00±0.00，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A，P<0.05)，此結(jié)果提示干擾siRNA成功轉(zhuǎn)染至肝癌HepG2細(xì)胞株中，并且顯著干擾HepG2細(xì)胞中USP9X的基因表達(dá)。而MTT增殖試劑盒結(jié)果揭示，肝癌HepG2細(xì)胞株中siRNA組的細(xì)胞增殖率在24、48和72 h時為0.0873 ± 0.0131、0.1047 ± 0.0128和0.1203 ± 0.0148，分別明顯低于NC組的0.1113 ± 0.0083、0.1333 ± 0.0062和0.1610 ± 0.0080且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B，P<0.05)。該結(jié)果進(jìn)一步提示沉默USP9X可呈時間依賴性的抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖能力，但具體機(jī)制仍需更全面實(shí)驗(yàn)探索分析。

A: 各組HepG2細(xì)胞中USP9X蛋白的表達(dá)；B: 沉默USP9X對HepG2細(xì)胞不同時間點(diǎn)增殖能力的影響；*: 與NC組比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

二、沉默USP9X顯著阻滯HepG2細(xì)胞由G0-G1期向S期轉(zhuǎn)化

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果揭示，siRNA組中處于G0-G1期HepG2細(xì)胞的數(shù)量占總數(shù)量的72.32% ± 1.53%，顯著高于NC組的56.30% ± 3.47%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而siRNA組處于S期的HepG2細(xì)胞的數(shù)量比為20.53% ± 0.66%，顯著低于NC組的37.73% ± 1.82%，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明了沉默USP9X可通過阻滯細(xì)胞G0-G1期向S期的轉(zhuǎn)化進(jìn)而抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖。

三、沉默USP9X顯著誘導(dǎo)HepG2自噬基因LC3-II以及Beclin1蛋白的表達(dá)

圖2結(jié)果揭示，siRNA組中肝癌HepG2細(xì)胞的LC3-II和Beclin1蛋白表達(dá)為1.47 ± 0.11和1.48 ± 0.19，明顯高于NC組的1.00±0.00，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A，P<0.05)，此結(jié)果說明沉默USP9X明顯誘導(dǎo)細(xì)胞自噬反應(yīng)進(jìn)而調(diào)控肝癌HepG2細(xì)胞的功能。

A: 各組HepG2細(xì)胞中Beclin-1和LC3-II蛋白的表達(dá)

討 論

越來越多的研究表明去泛素化酶DUB家族可通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白降解而廣泛參與肝癌的病理過程[5-7]。已有研究證實(shí)沉默USP9X可通過下調(diào)Mcl-1蛋白的表達(dá)從而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[8]。但由于肝癌的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡、增殖以及自噬等多個生物學(xué)過程密切相關(guān)，我們應(yīng)更深入全面地研究USP9X對肝癌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示肝癌HepG2細(xì)胞株的siRNA組中USP9X蛋白表達(dá)明顯低于NC組(P<0.05)，MTT結(jié)果提示沉默USP9X可呈時間依賴性地抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖能力，最終改善肝癌的發(fā)生(P<0.05)。進(jìn)一步地，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果揭示siRNA組中處于G0-G1期HepG2細(xì)胞的數(shù)量占比顯著高于NC組(P<0.05)，而siRNA組處于S期的HepG2細(xì)胞的數(shù)量比顯著低于NC組 (P<0.05)。此結(jié)果提示采用干擾siRNA技術(shù)在體外沉默肝癌HepG2細(xì)胞中USP9X基因的表達(dá)，增殖反應(yīng)主要受細(xì)胞周期調(diào)控，其中S期為細(xì)胞DNA復(fù)制、合成階段，其與細(xì)胞分裂密切相關(guān)，并且USP9X可顯著阻滯細(xì)胞從G0-G1期向S其轉(zhuǎn)化從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。因此，USP9X 在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，抑制 USP9X 表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，阻止肝癌細(xì)胞生長。

此外，siRNA組中肝癌HepG2細(xì)胞的LC3-II和Beclin1蛋白表達(dá)均顯著高于NC組(P<0.05)，此結(jié)果說明沉默USP9X明顯誘導(dǎo)細(xì)胞自噬反應(yīng)進(jìn)而調(diào)控肝癌HepG2細(xì)胞的功能。自噬是真核生物中的一種溶酶體降解系統(tǒng)，能夠降解長壽蛋白和破損的細(xì)胞器，可維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬在肝癌的病理過程中具有雙重作用，既可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡進(jìn)而抑制肝癌的形成，又可以在保護(hù)應(yīng)激狀態(tài)下的腫瘤細(xì)胞從而促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移[9]。但大多數(shù)研究認(rèn)為抑制自噬可誘導(dǎo)肝癌發(fā)生，而Beclin1和LC3-II基因則可代表自噬啟動和活化的標(biāo)志[10]。本研究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)siRNA組中的Beclin1 和LC3-II蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步提示USP9X可誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬從而影響肝癌細(xì)胞的功能。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了沉默USP9X通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生，從而抑制肝癌的病理過程。但基于肝癌復(fù)雜的病理機(jī)制和自噬在肝癌進(jìn)展中的雙重效應(yīng)，我們認(rèn)為仍需進(jìn)一步完善USP9X對肝癌細(xì)胞生物學(xué)作用的研究，而本研究的相關(guān)數(shù)據(jù)也為肝癌研究提供了可靠的理論依據(jù)。