葡萄糖轉運蛋白1抑制劑在結腸癌細胞奧沙利鉑耐藥中的作用

張江國 呂紅 吉明柱

[摘要] 目的 探討葡萄糖轉運蛋白1（GLUT-1）抑制劑在結腸癌細胞奧沙利鉑耐藥中的作用。 方法 將HT29細胞分為L-OHP敏感組及耐藥組，其中敏感組分為0 μM、4 μM、8 μM、16 μM、32 μM、64 μM L-OHP組，耐藥組分為0 μM、16 μM、32 μM、64 μM L-OHP組。采用實時聚合酶鏈反應（PCR）和蛋白質印跡法測定耐藥及敏感結腸癌細胞系葡萄糖轉運蛋白-1（GLUT-1）基因表達水平。用MTT法測定耐藥及敏感結腸癌細胞系細胞活力。 結果 低毒濃度的L-OHP處理可誘導結腸癌細胞系GLUT-1表達。與L-OHP敏感細胞系細胞相比，L-OHP耐藥細胞系細胞GLUT-1表達上調。WZB117對GLUT1的抑制顯著提高了L-OHP耐藥細胞對藥物的敏感性。 結論 結腸癌細胞對L-OHP的耐藥可能與GLUT1表達上調有關。GLUT1特異性抑制劑可以逆轉結腸癌細胞對L-OHP的抵抗。GLUT1可能是未來抗癌藥物發展的一個潛在目標。

[關鍵詞] 葡萄糖轉運蛋白1;葡萄糖轉運蛋白1抑制劑;結腸癌細胞;奧沙利鉑;化療;耐藥

[Abstract] Objective To investigate the role of glucose transporter 1（GLUT-1） inhibitor in oxaliplatin resistance in colon cancer cell. Methods HT29 cells were divided into L-OHP sensitive group and L-OHP resistance group， among which the sensitive components were 0 μM， 4 μM， 8 μM， 16 μM， 32 μM， 64 μM L-OHP group， and the resistance components were 0 μM， 16 μM， 32 μM， 64 μM L-OHP group. Real-time polymerase chain reaction（PCR） and Western blot were used to determine the expression level of glucose transporter-1（GLUT-1） gene in drug-resistant and sensitive colon cancer cells. The cell viability of drug-resistant and sensitive colon cancer cell lines was determined by MTT method. Results L-OHP treatment with low toxic concentration can induce the expression of colon cancer cell line GLUT-1. Compared with that of L-OHP sensitive cell line cells， the expression of GLUT-1 in L-OHP resistant cell line cells was up-regulated. The inhibition of GLUT1 by WZB117 significantly increased the sensitivity of L-OHP resistant cells to drugs. Conclusion The resistance of colon cancer cells to L-OHP may be related to the up-regulation of GLUT1 expression. GLUT1 specific inhibitors can reverse the resistance of colon cancer cells to L-OHP. GLUT1 may be a potential target for the development of anticancer drugs in the future.

[Key words] Glucose transporter type 1; Glucose transporter type 1 inhibitor; Colon cancer cells; Oxaliplatin; Chemotherapy; Drug resistance

結腸癌的化療作為手術切除腫瘤后的輔助治療手段，可以有效殺滅微小腫瘤灶及轉移灶，明顯提高術后無病生存率及延長總生存期。新一代化療藥物奧沙利鉑使得輔助化療上了一個新臺階。它是第三代鉑類抗癌藥物，藥理學特性和其他鉑類藥物相似，均以DNA為靶點。L-OHP的耐藥問題目前也已成為困擾臨床醫生的一大難題，其耐藥機制為DNA損傷修復、藥物解毒增加、藥物積聚減少、Fas相關磷酸酶-1表達上調等[1]。葡萄糖轉運蛋白（GLUT）是細胞膜上的跨膜糖蛋白，能介導細胞內外的葡萄糖以易化擴散的方式相互轉運。GLUT-1蛋白質是一種高度疏水的、糖基化程度各異的蛋白質，在缺氧及缺血的惡性腫瘤細胞中表達顯著增高，主要參與細胞基礎的葡萄糖轉運，在細胞能量代謝中起到極其重要作用。癌細胞主要依賴于葡萄糖提供能量，因此癌細胞對于葡萄糖剝奪敏感[2]。腫瘤細胞葡萄糖轉運增加主要是由于其細胞膜上GLUT-1上調所致，通過shRNA敲除GLUT-1基因可以增加頭頸部腫瘤對化療藥物順鉑的敏感性[3]，抑制GLUT1表達可增加結腸癌細胞的敏感性[4，5]，提示GLUT1有可能成為克服化療藥物耐藥的靶標之一。WZB117是一種新型的GLUT-1不可逆性抑制劑，可以顯著降低細胞內葡萄糖的攝入量及ATP水平，進而抑制糖酵解并抑制細胞生長。最近有報道指出WZB117刺激癌細胞可致GLUT-1蛋白表達明顯下調，細胞內ATP水平下降，進而引起AMP激活的蛋白激酶的增加、細胞周期蛋白E2以及磷酸化視網膜母細胞瘤抑癌蛋白下降，導致癌細胞周期停滯，衰老和壞死[6]。WZB117能夠通過抑制結腸癌細胞膜上的GLUT-1進而克服癌細胞對5氟尿嘧啶的耐藥性[7]。

本研究擬對GLUT1和GLUT1抑制劑WZB117在逆轉結腸癌細胞對L-OHP耐藥性中的作用進行相關研究，明確其在L-OHP耐藥性中的作用，為將來在耐化療藥的結腸癌靶向治療中提供新的武器。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

人結腸癌細胞HT29購自美國ATCC公司，樂沙定（注射用L-OHP）購自比利時Laboratoires Thissen公司，RPMI 1640培養液、新生小牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，MTT試劑盒購自上海碧云天公司，一步法Realtime RT-PCR試劑購自上海羽朵生物公司，Takara反轉錄試劑盒購自寶生物公司，抗GLUT1抗體購自英國abcam公司，WZB117購自Sigma-aldrich公司。

1.2 儀器與設備

BioTek ELx800全自動酶標儀購自美國BioTek公司，iCycler熒光定量PCR儀購自美國伯樂公司，Bio-rad凝膠成像系統購自美國伯樂公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 L-OHP耐藥的結腸癌細胞系的建立? 將人結腸癌細胞系HT29細胞放置于含有濃度依次增加的L-OHP的細胞培養基中進行培養，起始的L-OHP的濃度定為HT29細胞經MTT法檢測在540 nm波長光測定時吸光度減半時的濃度，后每2周濃度增加10%，挑出對L-OHP耐藥的單個克隆的結腸癌細胞進行培養，所有耐藥細胞均每4周重復進行L-OHP刺激，使用該細胞進行后續的實驗[8]。將上述細胞分為L-OHP敏感組及耐藥組，其中敏感組分為0 μM、4 μM、8 μM、16 μM、32 μM、64 μM L-OHP組，耐藥組分為0 μM、16 μM、32 μM、64 μM L-OHP組。

1.3.2 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應測定GLUT-1基因表達水平? 取對數生長期的耐藥株和敏感株HT29細胞，引物探針為Glut1：Forward：5-AACTCTTCAGCCAGGGTCCAC-3，Reverse：5-CA-CAGTGAAGATGATGAAGAC-3，采用RNA提取試劑盒提取，分光光度計測定RNA濃度及純度后按照反轉錄試劑盒說明進行反轉錄，條件為：37℃反轉錄1 h，85℃滅活反轉錄酶5 min。反轉錄后模板用兩步法進行擴增，擴增條件為：95℃預變性30 s;95℃變性5 s，60℃延伸30 s，40個循環。采用△△Ct法進行相對定量分析[7]。

1.3.3 Western blot測定GLUT-1蛋白表達水平? 收集敏感腫瘤細胞系和耐藥腫瘤細胞系腫瘤細胞，預冷PBS清洗后加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4℃ 12 000轉/min離心15 min后吸取上清，加1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液并100℃變性10 min。以20～30 μg的蛋白量進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，采用濕轉使蛋白轉至NC膜上，10%脫脂牛奶封閉1 h，加入抗GLUT1抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗室溫搖床孵育1 h。TBST洗滌3次，每次5 min，均勻滴加ECL發光液后用Bio-Rad凝膠成像儀顯影[7]。Image J軟件進行圖片條帶灰度值分析。

1.3.4 MTT法測定L-OHP及WZB117對敏感及耐藥腫瘤細胞系活性的影響? 收集對數生長期的HT29細胞，將其制備成105個/mL的細胞懸液。分別予100 μL接種于96孔板各孔中，邊緣孔用無菌PBS填充。37℃、5%CO2條件下培養24 h，實驗分組，加入不同濃度的藥物100 μL，每孔終體積為200 μL。各濃度各設18個復孔。培養72 h，在對照孔細胞達到90%融合后，在各孔加入5 mg/mL的MTT試劑20 μL，培養箱內孵育4 h，棄上清液，加入DMSO 150 μL，室溫下震蕩10～15 min，待紫色結晶完全溶解后，用酶標儀測定570 nm波長吸光度值。重復3次。細胞活性=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）。

1.4 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件分析數據。計量資料用（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 L-OHP誘導HT29細胞GLUT-1的表達

本研究分析了L-OHP作用HT29細胞后GLUT-1的表達情況。在低濃度的L-OHP處理24 h后，檢測HT-29細胞中GLUT1的表達。如表1所示（2-△△Ct法），L-OHP 4 μM時，GLUT1的mRNA表達表達量是空白對照組的（1.45±0.26）倍;L-OHP 8 μM時，GLUT1的mRNA表達量是空白對照組的（2.07±0.22）倍;L-OHP 16μM時，GLUT1的mRNA表達量是空白對照組的（4.99±0.91）倍，較對照組（未受L-OHP作用的HT-29細胞）明顯升高（P<0.05）。見圖1。L-OHP 0uM時HT-29細胞GLUT1相對蛋白表達量為（0.28±0.02）。4 μM、8 μM、16 μM時，HT-29細胞GLUT1的蛋白相對表達量分別為（0.83±0.04）、（1.55±0.55）、（1.72±0.11），較0 μM時明顯增加（P<0.05）。隨著L-OHP的濃度增加（最高濃度增加至16 μM），HT-29細胞的GLUT1水平明顯增加，且GLUT1表達呈L-OHP劑量依賴性模式。上述結果提示L-OHP作用于HT-29細胞可誘導GLUT1表達增加。見表1。

2.2 L-OHP敏感細胞和耐藥細胞中GLUT1的表達

為了明確GLUT1在HT-29細胞對L-OHP耐藥中的作用，分別檢測L-OHP敏感細胞和耐藥細胞中GLUT1的表達。如表2、圖2所示，16 μM L-OHP作用于耐藥細胞株的GLUT1 mRNA表達水平是敏感組的（4.430±0.684）倍，耐藥細胞株的GLUT1 mRNA表達較敏感細胞株明顯升高（P<0.05）。敏感細胞株的GLUT1 蛋白相對表達量是（0.35±0.03），耐藥細胞株的GLUT1蛋白相對表達量是（0.94±0.02），與敏感細胞株相比，耐藥細胞株的GLUT1蛋白水平明顯升高（P<0.05）。

2.3 L-OHP對敏感和耐L-OHP的HT-29細胞系細胞活性的影響

為了明確GLUT1表達增加是否是L-OHP耐藥的主要機制，本研究從HT-29細胞系中選擇L-OHP耐藥細胞。按照向征等[8]的方法建立耐L-OHP的HT-29細胞系，檢測不同濃度（0 μM、16 μM、32 μM、64 μM的L-OHP）作用72 h后L-OHP敏感HT-29細胞系和L-OHP耐藥HT-29細胞系細胞活性。如表3所示，16 μM L-OHP時敏感株及耐藥株的細胞活性分別為（0.79±0.05）和（0.89±0.02），32 μM L-OHP時敏感株及耐藥株的細胞活性分別為（0.58±0.04）和（0.87±0.02），64 μM L-OHP時敏感株及耐藥株的細胞活性分別為（0.31±0.05）和（0.74±0.01），L-OHP耐藥細胞株接受相同濃度的L-OHP作用后其活性較敏感細胞株明顯升高（P<0.05），提示耐藥細胞株對L-OHP耐藥。

2.4 L-OHP和WZB117對耐藥HT-29細胞系活性的影響

GLUT-1特異性抑制劑WZB117能有效抑制GLUT-1的表達，下調糖酵解，抑制癌細胞的生長。如表4所示，用L-OHP、WZB117及L-OHP和WZB117聯合作用于L-OHP耐藥細胞株。16 μM L-OHP作用的耐藥株的細胞活性為（0.86±0.03），5 μM WZB117作用的耐藥株的細胞活性為（0.75±0.01），16 μM L-OHP和5 μM WZB117聯合作用的耐藥株的細胞活性為（0.46±0.02），這表明L-OHP和GLUT-1抑制劑WZB117聯合使用對結腸癌細胞活性的抑制作用明顯強于單獨使用上述任何一種藥物（P<0.01）。WZB117對GLUT-1的抑制顯著提高了L-OHP對耐藥細胞的抑制作用。GLUT-1可能是克服結腸癌L-OHP耐藥的一個治療靶點。

3 討論

L-OHP常用于結直腸癌的化療，癌細胞產生對L-OHP的耐藥性是化療失敗的常見原因。常見L-OHP的耐藥機制為DNA損傷修復、藥物解毒增加、藥物積聚減少、Fas相關磷酸酶-1表達上調等[1]。本研究首次發現，隨著L-OHP的濃度增加，HT-29結腸癌細胞的GLUT-1水平明顯增加，且GLUT-1表達呈L-OHP劑量依賴性模式。GLUT-1高表達的HT-29細胞耐藥株在多重濃度的L-OHP下表現出更強的存活能力。參與葡萄糖代謝的GLUT-1高表達導致結腸癌細胞對L-OHP耐藥，這可能是結腸癌細胞對L-OHP耐藥的一種新的機制。

L-OHP作用于HT-29細胞的半抑制濃度（IC50）約為32 μM，因此本研究檢測了0 μM、8 μM、16 μM的L-OHP作用于HT-29細胞后GLUT-1基因的表達量，發現在L-OHP16 μM時的GLUT-1的表達量最高，和汪峰等的研究結果相似，因此在后續的實驗中選擇16 μM L-OHP作用于敏感及耐藥細胞株[9]。

Warburg效應是指與正常的細胞相比，癌細胞更喜歡利用有氧糖酵解而不是線粒體氧化磷酸化來產生能量[10]。通過增強Warburg效應可增強結直腸癌細胞的生長，而抑制Warburg效應可明顯抑制結直腸癌細胞的生長[11-13]。參與癌細胞有氧糖酵解的GLUT-1表達增加促進癌細胞的增長[14，15]，而GLUT-1特異性抑制劑WZB117通過抑制癌細胞膜GLUT-1的活性進而耗盡細胞內的ATP從而使細胞發生衰老和壞死[6]。Liu W等[7]研究也發現WZB117能有效抑制5氟尿嘧啶耐藥的結腸癌細胞GLUT-1的表達，進而產生協同抗癌作用。為了進一步明確GLUT-1在L-OHP耐藥中的作用，本研究進行了L-OHP和WZB117對耐藥HT-29細胞系活性影響的實驗。和上述結果相似，本研究首次觀察到L-OHP和WZB117聯合作用于人結腸癌細胞可產生協同抗腫瘤作用，其可能的機制為WZB 117抑制GLUT-1的活性，進而抑制Warburg效應而逆轉結直腸癌細胞對L-OHP的耐藥性。

總之，本研究發現結腸癌細胞對L-OHP的耐藥可能與GLUT-1表達上調有關，而GLUT-1特異性抑制劑可逆轉結直腸癌細胞對L-OHP的耐藥性。GLUT-1可能是未來抗癌藥物發展的潛在靶點。

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（收稿日期：2020-02-17）