蛋白免疫印跡的發展和應用

吳妮妮 周濤

【摘 ?要】蛋白免疫印跡（Western Blot）是分子生物學和蛋白質組學中最常用的技術之一，最初建立于20世紀70年代末，至今仍被積極使用。傳統蛋白免疫印跡方法存在著分辨率低、假條帶、靈敏度低和蛋白質完整性差等缺點。多年來，蛋白免疫印跡的技術一直在不斷更新，致力于更快地獲得準確的結果。蛋白免疫印跡也能對多種疾病的進行檢測，改進蛋白免疫印跡靈敏度和重復性，才能更大程度上實現其在臨床上的應用。

【關鍵詞】Western Blot;免疫印跡;蛋白質;抗體

Western blot是一種常用的蛋白質檢測方法，可以提供目標蛋白的半定量或定量數據，也可用于檢測蛋白的表達。免疫印跡法由Southern Blot進化而來，后者用于檢測凝膠電泳分離的DNA片段中的特定DNA序列[1]。20世紀70年代末，Towbin等人（1979）利用聚丙烯酰胺-尿素凝膠電泳分離蛋白質，并將其轉移到硝化纖維素膜上。伯內特（1981）后來使用了更廣泛使用的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），最終導致這種方法被稱為Western Blot[2]。

通過使用蛋白免疫印跡，研究人員能夠從提取的復雜蛋白質混合物中識別出特定的來自細胞的蛋白質。這項技術使用三個要素來完成這項任務：（1）按大小分離，（2）轉移到固體載體上，（3）用適當的一抗和二抗標記靶蛋白。這些結果被轉移到一種膜上，為每種蛋白質產生一條帶。然后，該膜與特定目的蛋白質的標簽抗體一起孵育。未結合抗體被洗掉，只剩下與抗體結合的目的蛋白質。然后通過顯影膠片檢測結合抗體由于抗體只與目的蛋白質結合，所以只有一條帶是可見的。條帶的厚度與蛋白質的存在量相對應;因此，需要做一個標準對照可以指示蛋白質的存在量[3]。

蛋白免疫印跡技術的發展

20世紀70年代末建立的蛋白免疫印跡技術至今仍在積極應用。然而，這種傳統的蛋白免疫印跡方法存在著分辨率低、假條帶、靈敏度低和蛋白質完整性差等缺點，近年來的進展極大地改進了標準蛋白免疫印跡方法的許多方面，以產生更高質量和定量的數據。雙Tris凝膠系統是傳統Laemmli系統的替代品，不僅可以使蛋白質更好分離，保持蛋白質完整性，分辨率更高，并將電泳時間縮短至35分鐘。此外，iBlot干吸系統通過減小電極之間的距離來提高傳輸速度，在7分鐘內顯著提高了蛋白質轉移到膜上的效率和速度。該傳輸系統較傳統方法提高了效率，減少了轉移時間[4]。雖然化學發光技術是蛋白質蛋白質檢測中最常見和最傳統的技術，但雙色紅外熒光檢測能大大提高靈敏度、質量，以及數據的準確性。這種檢測方法利用紅外激光在700nm和800nm兩種最佳波長下激發，生成信號最大的清晰數據圖像比率和最高敏感度。因此，兩個靶蛋白可以同時在同一膜上使用700nm和800nm的熒光檢測通道可視化[5]。

蛋白免疫印跡的臨床應用

蛋白免疫印跡技術可以從鑒定復雜混合物中的特定蛋白質到直接檢測單個細胞中的蛋白質，通過單細胞Western印跡，可以在復雜的細胞群中同時分析大約2000個細胞中的細胞-細胞變異。隨著完整細胞成像的整合，該技術允許在化療藥物柔紅霉素治療的人膠質母細胞瘤細胞中，在異質性腫瘤細胞群體中識別單個耐藥腫瘤細胞及其亞型的蛋白質表達變化[6]。隨著雙向凝膠分離技術的應用以及通過肽質量指紋識別蛋白質，使得臨床相關幽門螺桿菌在相關胃病（慢性胃炎、十二指腸潰瘍）中的分析成為可能[7]。

蛋白免疫印跡通常用于臨床診斷各種寄生蟲和真菌疾病，應用于先天性弓形蟲病的早期和敏感診斷[8]，并被用于嚴重感染性疾病副球蟲病（PCM）[9]的快速和敏感血清學診斷。在一項研究中，該試驗成功地用于農民肺病（FLD）的可靠血清學診斷，FLD是一種由吸入抗原顆粒引起的肺部疾病。因此，該技術可用于FLD的臨床快速常規診斷[10]。

因此，隨著進一步提高蛋白免疫印跡的靈敏度和重復性，蛋白免疫印跡技術的臨床應用將繼續向前發展，為人類的疾病診斷提供重要的技術支持。

參考文獻：

[1]He M，Herr AE. Polyacrylamide gel photopatterning enables automated protein immunoblot in a two-dimensional microdevice. J Am Chem Soc，2010;132（8），2512–2513.

[2]Murphy RM，Lamb GD. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques：down-sizing Western blot up-sizes outcomes. J Physiol，2013;591（23），5823–5831.

[3]MahmoodT，YangP.Westernblot：Technique，theory，andtroubleshooting.NorthAmJM edSci2012;4：429-34.

[4]iBlot Dry Blot System. Life Technologies Corporation. 25-0911，84（2012）.

[5]Western Blot Analysis. LI-COR Biosciences. 988-12622，12（2012）.

[6]Kang CC，Lin JM，Xu Z，Kumar S，Herr AE. Single-cell Western blot after whole-cell imaging to assess cancer chemotherapeutic response. Anal Chem，2014;86（20），10429–10436.

[7]Hamm M，Ha S，Rustandi RR. Automated capillary Western dot blot method for the identity of a 15-valent pneumococcal conjugate vaccine. Anal Biochem，2015;478，33–39.

[8]Perenha-Viana MC，Gonzales IA，Brockelt SR，Machado LN，Svidzinski TI. Serological diagnosis of paracoccidioidomycosis through a Western blot technique. Clin Vaccine Immunol，2012;19（4），616–619.

[9]Head MW，Yull HM，Ritchie DL et al. Variably protease-sensitive prionopathy in the UK：a retrospective review 1991–2008. Brain，2013;136（Pt 4），1102–1115.