殼聚糖通過減少自由基堆積提高對運動訓練小鼠抗疲勞能力的實驗研究

王耀東，邱 麗，孫夢佳

運動疲勞是指機體不能將機能保持在某一特定水平和/或不能維持某一特定運動強度[1]。力竭是疲勞的一種特殊形式，是疲勞發展的最后階段。機體內自由基的生成與消除處于動態平衡，使得機體的內環境維持在相對穩定的狀態。研究表明，力竭時體內血乳酸（LD）和氧化自由基堆積，造成細胞工作負荷加重，能夠引起肌纖維傷害，進而影響運動能力[2-3]。自由基拮抗的研究成為各領域學者聚焦的新熱點，如殼聚糖（chitosan）等作為運動營養補劑已較多利用于臨床[4]。殼聚糖在體內有較好的生物相容性，研究報道殼聚糖具有調節免疫、降低血脂/膽固醇、促進動物肝內自由基代謝的功能[5-8]。本研究擬通過對游泳訓練小鼠進行低、中、高劑量的殼聚糖干預來研究其對肝臟抗氧化因子超氧化物歧化酶（SOD）及Hb（HB）、血乳酸（LD）及丙二醛（MDA）表達的影響，為殼聚糖協同運動訓練的抗疲勞能力機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

3月齡健康雄性昆明（KM）小鼠82只，體重（38.05±4.95）g（由清華大學醫學樓藥物學系提供）。分籠飼養，自由進食飲水，室溫控制在（23±3）℃。適應性喂養1 周后，按照體重隨機分為安靜對照組（Control，CT）、安靜服藥組（Control+Chitosan，CC）、游泳訓練對照組（Swimming training，ST）和聯合干預組組（Swimming training+Chitosan，SC）4組，其中，CC組和SC組又按照低（D1：0.2g/kg）、中（D2：0.3g/kg）、高（D3：0.4g/kg）劑量組內分為3個亞組[9]。

1.2 小鼠游泳訓練模型建立

游泳訓練設施：泳槽80 cm×55 cm×38 cm，水溫控制在（26±2）℃，水深不低于28 cm（以小鼠尾巴無法觸碰到箱底為宜）。

本實驗模擬運動員賽前6 周訓練計劃，制成圖1 的強度曲線圖，小鼠具體運動訓練計劃見表1。游泳訓練方案為6天/周，第3、5、6天進行較高強度訓練，SC組的亞組訓練前灌服不同濃度殼聚糖，灌服30 min 后再進行游泳訓練。第7 周進行一次性力竭實驗，測定游泳至力竭時間，入水開始計時，小鼠連續10 s口鼻沒入水面無法露出，且放在平面上無法完成翻正反射時停止計時。

圖1 運動員和小鼠運動強度曲線圖（強度0～5級）Figure 1 Curve of Exercise Intensity of Athletes and Mice（intensity 0～5）

表1 運動訓練計劃Table 1 Exercise Design

1.3 樣品采集與制備

樣品采集：第7 周所有組大鼠負重力竭即刻采眼底血于加入含有肝素鈉的EP管中，取部分抗凝血樣用蛋白沉淀劑及時制備成乳酸上清液，4 ℃保存待用，剩余抗凝血樣，4 ℃保存待用。取血后小鼠均采用脫頸處死，迅速取腦、肝、心、脾及雙側腿部腓腸肌，其中，腦、干、心、脾分別于電子天平準確稱重。腦和心置于福爾馬林浸泡，留待切片；其余臟器用錫箔紙包裹用液氮速凍，置于-40 ℃冰箱中保存。

制備心肌切片：HE染色法對小鼠心肌組織進行染色，切片機連續切片，于電子顯微鏡下觀察并連接電腦照相測量心壁厚度。

制備上清液：肌肉/肝臟樣品，放入4 ℃生理鹽水中進行清洗，去除血液，在濾紙上拭干多余水分，準確稱取組織的重量，按照重量（g）：體積（ml）=1：9 的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下進行手動機械勻漿，制備成10%組織勻漿，離心2 500 rpm，15 min，取上清，根據不同的需要用生理鹽水稀釋成不同濃度的組織勻漿，備用待測。

1.4 指標檢測

全血HB 含量：使用比色法測試盒進行Hb 含量的測定，利用公式計算Hb 含量（g/L）=（測定管OD 值-空白管OD 值）×367.7，得到數值。

實驗中所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定操作按試劑盒說明進行。

1.5 數據統計與分析

采用Sigmaplot 13.0（Systat Software，Inc）做圖，SPSS 21.0進行統計結果的分析，數據統計結果用均值±標準差表示。采用單因素方差分析（One way ANOVA）檢驗多組間差異；所有數據以P<0.05視為具有統計學意義。

2 研究結果

2.1 游泳至力竭時間的測定結果

圖2 小鼠負重6%游泳至力竭時間所需時間（s）Figure 2 Time Required for Mice to Swim to Exhaustion with 6%Load（s）

2.2 血液指標測定結果

圖3顯示，D1和D2、D3劑量干預組較CT組小鼠Hb含量均無顯著差異（P>0.05）；SC+D1組Hb含量較ST組雖有上升趨勢，但數據統計無顯著差異（P>0.05），而SC+D2和SC+D3組較ST組小鼠Hb含量均顯著增加（P<0.05）。

圖3 小鼠HB含量Figure 3 HB Content in Mice

圖4 顯示，CT + D1 組小鼠LD 濃度較CT 組無顯著變化（P>0.05），而CT+D2和CT+D3組較CT均顯著降低（P<0.05）；中、高劑量訓練組較ST 組LD 含量均顯著下降（P< 0.05），但SC+D1組較之無顯著改變（P>0.05）。

圖4 小鼠LD含量Figure 4 LD Content in Mice

2.3 各組織SOD和MDA表達測定結果

小鼠腓腸肌SOD 活性檢測結果發現，D1 劑量安靜組與訓練組分別與CT 組和ST 組相比較均無顯著差異（P>0.05），但D2 和D3 劑量的殼聚糖干預較CT 組可顯著提升小鼠腓腸肌SOD 活性（CT + D2 vs CT，P< 0.01；CT + D3 vs CT，P< 0.05）；在ST 聯合殼聚糖干預組中結果類似，D1 劑量聯合ST 較ST 組無顯著變化，但D2 和D3 劑量干預均可顯著提升SOD 活性（SC+ D2 vs ST，P< 0.01；SC + D3 vs ST，P<0.05，圖5 A）。

小鼠腓腸肌中MDA檢測結果發現，殼聚糖干預組內，D1至D3 藥物干預組較CT 組的MDA 值均無顯著差異（P>0.05）；殼聚糖聯合游泳訓練干預組內，低劑量的干預不能顯著降低運動訓練小鼠腓腸肌中的MDA（P>0.05），但SC+D2和SC+D3組較ST組的MDA含量均顯著下降（P<0.05，圖5 B）。

圖5 小鼠腓腸肌SOD活性和MDA含量結果Figure 5 SOD Activity And Mda Content Of Gastrocnemius Muscle in Mice

小鼠肝臟SOD 活性檢測結果發現，D1 劑量安靜組與訓練組分別與CT 組和ST 組相比較均無顯著差異（P>0.05），但D2和D3 劑量的殼聚糖干預較CT 組均可顯著提升小鼠腓腸肌SOD 活性（P<0.01）；在ST 聯合殼聚糖干預組中結果類似，D1劑量聯合ST 較ST 組無顯著變化，但D2 和D3 劑量干預均可顯著提升SOD活性（P<0.01，圖6 A）。

小鼠肝臟MDA 檢測結果發現，殼聚糖干預組內，D1 至D3藥物干預組較CT 組的MDA 值均無顯著差異（P>0.05）；殼聚糖聯合游泳訓練干預組內，低劑量的干預不能顯著降低運動訓練小鼠肝臟的MDA（P>0.05），但SC+D2 和SC+D3 組較ST組的MDA含量均顯著下降（P<0.01，圖6 B）。

圖6 小鼠肝臟SOD活性和MDA含量結果Figure 6 Results of SOD Activity And Mda Content in Mouse’s Liver

2.4 肌糖原和肝糖原含量測定結果

圖7 A 顯示，與CT 組相比，D1 至D3 的安靜組小鼠腓腸肌內的肌糖原含量無顯著改變；與ST 組相比，SC+D1 組肌糖原含量無顯著增加（P>0.05），但SC+D2 和SC+D3 組的增加幅值明顯，且具有顯著性差異（P<0.01）；小鼠肝臟糖原含量測定結果顯示，安靜組內各亞組間無顯著差異（P>0.05），聯合干預組內，SC + D1 組較ST 組雖有提升但不具有統計學意義（P>0.05），SC+D2和SC+D3較ST組均顯著增加（P<0.01）。

圖7 小鼠肌糖原和肝糖原含量測定結果Figure 7 Determination Rresult of Muscle Glycogen and Liver Glycogen in Mice

2.5 小鼠心臟組織切片圖

圖8所示，可以明顯觀察到，服藥訓練組的小鼠心臟壁的厚度明顯要厚于安靜對照組的小鼠心臟壁厚度，并且在所有組別中0.3g 殼聚糖/kg 小鼠體重訓練組的小鼠在飼養6 周后心臟壁厚度增加最為明顯。心臟壁厚度的增加使小鼠運動時血氧量、心臟的供氧方面以及心臟收縮的力度速度等相關的能力均有所增加。

圖8 CT組和SC+D2組小鼠心臟組織切片Figure 8 Heart Tissue Sections of Mice in Ct Group and Sc+D2 Group

3 分析與討論

殼聚糖作為成熟的營養補劑，在調節免疫、抗氧化應激及組織修復的積極效應已被證實。近年來，殼聚糖應用于抗運動疲勞成為研究熱點，其作為提升運動訓練效果的補充因子效果得到公認，但相關機制尚未明確。本研究以殼聚糖作為干預補劑，觀察其對延緩運動訓練小鼠疲勞及促進疲勞恢復的協同效應，采用Hb、血乳酸值作為訓練負荷監控指標，肝臟和骨骼肌中MDA 含量來評價組織過氧化損傷程度，并結合SOD 酶活性評價小鼠肝、肌組織對自由基清除能力，從而揭示殼聚糖介導的力竭延緩的相關機制。

3.1 殼聚糖對運動訓練小鼠Hb、血乳酸的影響

Hb是紅細胞中一種含鐵寡聚蛋白，除參與氧氣和二氧化碳的運輸外，還參與細胞內酸堿穩態的調節。多項研究表明，Hb與運動負荷密切相關，測定其含量有助于監控機體對負荷的適應及機能水平狀況[10-12]。血乳酸耐受和消除速率作為耐力訓練敏感指標得到運動和醫學界的廣泛認可，在定量負荷和遞增負荷情況下，血乳酸濃度與Hb飽和度呈負相關關系[13-15]。

殼聚糖對于人體有很強的親和性，具有一定的抑菌和殺菌的能力，可以降低和分解膽固醇，吸附氯離子和一些有害的重金屬分子，也可以對癌細胞的轉移起到阻礙的作用，活化機體組織的細胞，增強機體的免疫力，調節體內液體的酸堿平衡，進而對現代人容易得的心腦血管方面的疾病、糖尿病、高血壓、高血脂、過度肥胖以及肝臟方面的疾病都有一定程度的治療效果[16-19]。

本研究小鼠訓練方案模擬游泳訓練運動員運動方案，游泳訓練的效果能否達到預期，依賴于合理的負荷安排；高運動負荷是游泳訓練技能提升的重要保障因素，但同時容易導致疲勞的出現，因此疲勞的生理生化監控至關重要。本研究結果顯示，中、高劑量的殼聚糖補劑可顯著提升運動訓練小鼠血液的Hb含量，降低LD濃度，促進乳酸消除，有效延緩力竭出現時間；組織切片的形態結構也表明中高計量殼聚糖補給具有一定的抗疲勞能力，且對運動訓練效果具有協同效應，聯合干預組較殼聚糖組顯著提升，干預效果具有殼聚糖劑量依賴性。

3.2 殼聚糖和游泳訓練對小鼠各組織抗氧化因子的影響

能量耗竭、自由基堆積、內環境紊亂被認為是運動疲勞產生的生理機制之一[20]。力竭運動時，機體耗氧量急劇增加，約2%～5%吸入的氧氣量在體內被還原為氧自由基。正常狀態下，體內抗氧化因子如SOD 對氧自由基進行清除或抑制其生成，使氧自由基的產生和消除處于動態平衡狀態[21]。在該穩態下的氧自由基濃度維持在安全線，對機體不會產生危害。當力竭或疲勞產生時，自由基產生速率大于清除速率，過多的氧自由基會攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸，產生氧化應激反應，損害組織細胞的功能，該過程被認為是運動疲勞產生的分子機制之一[22-23]。

SOD以氧自由基為底物，催化超氧陰離子自由基進行歧化反應，從而抑制自由基產生，保護細胞膜[24]。有氧運動訓練被認為可通過提升抗氧化酶活性，清除體內過多自由基來減輕組織細胞內的氧化應激反應[25]。基礎研究發現，殼聚糖能夠增加力竭小鼠肝組織中的SOD活性，有效抑制內源性自由基對肝臟組織的損害，提升小鼠運動表現[5，26]。外源性殼聚糖補充進入體內后，殼聚糖結構中的氨基和羥基和與氧化自由基結合后將其清除，同時殼聚糖良好的生物相容性可促使其與力竭后酸性代謝產物結合，改善胞內酸堿環境；此外，殼聚糖可促進肝糖原合成，提升體內肝、肌糖原儲備，為機體高強度和長時間運動過程中的能量供應提供保證[27-29]。

本研究通過游泳訓練聯合殼聚糖探討殼聚糖的抗疲勞作用，結果發現，殼聚糖灌服組和聯合運動干預組大鼠肝臟和腓腸肌內的MDA均顯著降低，同時SOD和肝、肌糖原含量顯著上升，這提示殼聚糖可增強小鼠抗脂質過氧化，減輕氧化應激反應，促進自由基的清除，從而延緩疲勞的發生，加速疲勞后恢復，這與前述研究結果較為一致。

4 結 論

中、高劑量殼聚糖灌服可顯著提高運動訓練小鼠Hb水平、降低LD 濃度，增強血液攜氧運氧；同時，殼聚糖提高運動訓練小鼠SOD酶活性，可加速自由基清除，減緩氧化應激反應速度，從而抑制MDA 的的形成，以上可能是殼聚糖提延緩運動訓練小鼠力竭出現，緩解運動疲勞的分子機理之一。