一株水霉拮抗菌的篩選、鑒定及抑菌穩定性研究

王旭

（遼東學院海岸帶生物技術研究所，遼寧 丹東 118003）

水霉病是世界性淡水養殖魚類的病害，各種淡水成魚、魚苗和魚卵都可發生，傳染性強，發病率及死亡率高[1]。該病的病原為卵菌綱，水霉屬真菌[2]。寄生水霉Saprolegnia parasitica 是目前已發現的最重要的病原菌，其孢子萌發快，侵襲能力強，幾乎能夠感染包括鯽Carassius auratus 斑馬魚Barchydanio rerio、鱘Acipenser 及鱸Lateolabrax japonicus 等在內的所有淡水魚類及其卵[3-6]。孔雀石綠曾是治療水霉病最有效的化學試劑，但其強致畸、致癌及高殘留，已被禁用。目前防治水霉病主要采用抗生素、殺菌劑、中草藥、氧化劑等[7-13]。這些方法易造成水霉的耐藥性、效果不明顯、成本高、有效濃度超出安全限量等問題，使用受限[14]。研究發現，有些微生物來源的活性成分可以抑制真菌的生長和感染，且具有綠色、環保、安全、高效的優點[15]。其中，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、地衣芽孢桿菌Baclicus lincheniformis 等具有非致病、耐儲存、使用方便等特點，是目前水產養殖中應用最為廣泛的益生菌[16，17]。本試驗以寄生水霉為靶標菌，通過平板對峙培養，篩選出抑制水霉生長的芽孢桿菌，并研究其抑菌穩定性，以期為水霉病的生物防治提供優良菌種資源和基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

靶標菌株SMJ-1 及其他寄生水霉菌株SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4 分別分離自遼寧省東港市淡水養殖池塘的散鱗鏡鯉Cyprinus carpio var.specularis 發病組織和卵，彭澤鯽Carassius auratus var.pengze、大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus 的發病組織。經純化、致病性測定和分子鑒定，確定其均為寄生水霉。待篩選菌株為分離保藏的27 株細菌菌株，保存于遼東學院農學院微生物工程實驗室。

1.1.2 培養基

細菌培養采用牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂20.0g、水1000mL，pH7.2～7.6。水霉培養和平板對峙試驗采用PDA 培養基：馬鈴薯200.0g、葡萄糖20.0g、瓊脂20.0g、水1000mL，自然pH。

1.1.3 拮抗菌基因組DNA 提取及16S rRNA 序列擴增試劑

Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、Premix Taq Version 2.0 （Loading dye mix）、DNA Marker（DL-2000）購自寶生物工程（大連）有限公司，引物27F/1492R（27F：5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’；1492R：5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌篩選

初篩：采用平板對峙法。將活化后的寄生水霉用直徑0.6cm 的無菌打孔器制備菌餅，接種于PDA平板中央，18℃培養24h 后，采用十字交叉法，在距離靶標菌餅2cm 處對稱點接待篩選菌株，以不接菌一側為對照。置于18℃培養箱中培養，至對照一側長滿平板后測量抑菌帶寬度，確定待篩菌株的抑菌效果。

復篩：采用發酵液抑菌試驗。初篩所得拮抗菌株接種于裝量40%的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，30℃發酵48h。發酵液經細菌濾器過濾后，按照1∶5 的比例與55℃的PDA 培養基混合均勻，制備平板。冷卻后，在平板中央接種寄生水霉菌餅，以無菌水為對照，每個處理3 次重復，于18℃培養至對照長滿平板后，測量各處理的菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率（%）=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑/對照菌落生長直徑）×100。

1.2.2 拮抗菌鑒定

1.2.2.1 形態學特征

將純化的拮抗菌劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養基上，30℃培養24h，觀察菌落形態、顏色等性狀。挑取少量菌體制備抹片，經革蘭氏染色后，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[18]，在顯微鏡下觀察染色特征、菌體形態及特殊結構。

1.2.2.2 拮抗菌16S rRNA 序列分析

拮抗菌基因組DNA 提取按照Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR 步驟要求進行。16S rRNA 序列擴增采用通用引物27F/1492R，擴增體系和反應程序參照李娟等[19]。擴增產物經生工生物工程（上海）有限公司測序，所測序列在Genbank 數據庫中進行Blast 對比分析。運用Clustal X（Version 1.83）和Mega 6.06 軟件[19]進行多重序列比對并構建系統發育樹。

1.2.3 拮抗菌傳代穩定性測定

將拮抗菌菌液以5%的接種量接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中傳代培養，每48h 轉接1 次，連續傳代10 次，每個處理設3 次重復。發酵液抑菌試驗測定出發菌株與傳代菌株對寄生水霉的抑菌效果，根據抑菌率變化分析傳代對拮抗菌抑菌效果的影響。

1.2.4 拮抗菌發酵液熱穩定性測定

用牛肉膏蛋白胨液體培養基發酵拮抗菌，將5%的試驗菌株菌液接種于裝量為40%的500mL 三角瓶中，30℃，120 r/min，培養72 h。發酵液采用無菌濾膜過濾，濾液4℃冷藏備用。

取各發酵濾液15mL 分別加入到20mL 直口離心管中，置于10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃下處理2h。之后，按照1∶5 的比例，將處理后的發酵濾液分別與滅菌后冷卻至55℃的PDA 培養基混合均勻制備平板。每個平板中央接種寄生水霉菌餅，每個處理重復3 次，18℃培養至對照長滿平板后，測量各處理菌落直徑，計算抑菌率，檢測不同溫度對試驗菌株發酵濾液抑菌活性的影響。

1.2.5 拮抗菌發酵液酸堿穩定性測定

拮抗菌無菌發酵濾液制備方法同1.2.4。取發酵濾液15mL 分別加入到20mL 直口離心管中，用1mol/L HCl 和1mol/L NaOH 分別調pH 至5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0，室溫靜置24h 后，將各管中的pH 調回至未經處理的發酵濾液pH6.8。之后按照1∶5 的比例，將處理后的發酵濾液分別與滅菌后冷卻至55℃的PDA 培養基混合均勻制備平板。每個平板中央接種寄生水霉菌餅，不經處理的發酵濾液作為對照，每個處理重復3 次，18℃培養至對照長滿平板后，測量各處理菌落直徑，計算抑菌率，檢測不同pH 處理對試驗菌株發酵液抑菌活性的影響。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌篩選

試驗以寄生水霉SMJ-1 為指示菌，通過平板對峙法篩選獲得1 株對水霉病原菌具有顯著拮抗作用的菌株YB5（圖1），其抑菌圈直徑達24.6mm，發酵液抑菌率達72.90%。該菌株對其他寄生水霉的拮抗作用試驗結果顯示：該菌對不同來源的寄生水霉（SMJ-2、SMJ-3、SMJ-4）均表現出顯著的抑制作用。

2.2 拮抗菌鑒定

2.2.1 拮抗菌YB5 的形態特征

菌株YB5 在牛肉膏蛋白胨培養基上的菌落呈圓形或不規則形，邊緣粗糙，表面粗糙褶皺，白色不透明（圖2）。顯微鏡下該菌革蘭氏染色陽性，細胞大小（1.5～1.8）×（0.5～0.6）μm，無莢膜，有芽孢。芽孢位于菌體中央，不膨大，柱狀，大小為（0.7～0.9）×（0.5～0.6）μm（圖3）。對照《常見細菌系統鑒定手冊》，菌株YB5 的形態學特征與已知的芽孢桿菌屬Bacillus 一致。

2.2.2 拮抗菌YB5 的16S rRNA 序列分析

以菌株YB5 的基因組DNA 為模板，1492R/27F為通用引物，經PCR 擴增和序列測定獲得長度為1208 bp 的堿基序列（GenBank accession number：MN121126）。所測序列在NCBI 數據庫中的Blast 結果顯示，菌株YB5 與特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis 的16S rRNA 序列相似性達99%。選取并下載典型菌株序列，以其近源屬雙芽孢桿菌屬Amphibacillus 模式種Amphibacillus sxylans 為外群構建系統發育樹。結果如圖4 所示，菌株YB5 與特基拉芽孢桿菌聚類在一個分支上，結合其形態結構特征，菌株YB5 鑒定為特基拉芽孢桿菌。

2.3 拮抗菌傳代穩定性測定

拮抗菌株YB5 和其傳代菌株發酵濾液的抑菌試驗結果如表1。拮抗菌YB5 繼代培養菌株與出發菌株之間抑菌效果差異不顯著（P＞0.05），說明該拮抗菌抑菌效果傳代穩定。

2.4 溫度變化對拮抗菌發酵液抑菌活性的影響

溫度變化對菌株YB5 發酵液抑菌穩定性的影響結果如圖5 所示，10～70℃范圍內樣品的抑菌活性無顯著性差異（P＞0.05），表明在此范圍內溫度變化對菌株YB5 發酵液中的抑菌物質的活性沒有影響，該菌株發酵液對溫度變化具有良好的耐受性。

2.5 拮抗菌發酵液酸堿穩定性

pH 變化對YB5 發酵液抑菌活性的影響結果如圖6 所示。試驗菌株發酵濾液的抑菌活性對酸堿度變化較為敏感，pH＜7.0 或pH＞8.0，抑菌率顯著下降（P＜0.05），僅在pH7.0～8.0 范圍內抑菌活性較為穩定，表明菌株YB5 發酵液中抑菌物質的活性受pH影響較大，在pH7.0～8.0 范圍內抑菌作用穩定。

3 討論

目前，水霉病的防治仍然缺乏安全有效的方法，以化學藥物、抗生素、疫苗以及中草藥等進行防治亦存在各自的缺點和不足。利用拮抗菌及其發酵產物能綠色、環保、安全、高效地防治水霉病，已成為水霉病防控研究的主流方向[3]。研究表明，一些細菌如芽孢桿菌和放線菌對水霉菌具有良好的抑制作用。張書俊[20]等篩選出一株能明顯抑制水霉菌菌絲體生長與孢子萌發的粘質沙雷氏菌Serratia marcescens 菌株LD038。賀鳳等[21]從海底沉積物中分離、篩選水霉拮抗菌株海洋鏈霉菌Streptomycesmarinensis S26，其產生的活性物質對病原水霉真菌有較強的抑制作用，并對外界環境變化有較強的適應能力。梁永增[22]篩選的芽孢桿菌Bacillus sp.菌株JL04 和短小芽孢桿菌Bacillus pumilus JL50 對水霉菌均具有顯著抑制作用，兩株拮抗菌對魚體沒有毒性，且傳代穩定。本研究從實驗室分離保存的27 株細菌中篩選獲得一株對水霉具有顯著拮抗作用的芽孢桿菌菌株YB5。該菌株對不同來源的多株寄生水霉均顯示出明顯的抑制作用。對其形態學特征及16S rRNA 基因序列比對分析，可知菌株YB5 為芽孢桿菌屬的特基拉芽孢桿菌。該結果是特基拉芽孢桿菌對水霉菌具有拮抗作用的首次報道。

表1 YB5 及其繼代培養菌株對寄生水霉的抑制作用Tab.1 Inhibition rate of YB5 and its subculture against S.parasitica

特基拉芽孢桿菌YB5 經傳代培養后，對水霉菌拮抗作用穩定，表明其具有良好的傳代穩定性。該菌發酵濾液經10～70℃低溫及高溫處理后，抑菌活性穩定。淡水養殖水體的溫度變化范圍一般為0～34.6℃[23]，菌株YB5 發酵產物表現出對養殖環境溫度變化的良好適應性。該菌的發酵產物抑菌活性對環境的pH 波動較為敏感，僅在pH7～8 范圍內具有與對照差異不顯著的抑菌效果。一般來說，淡水養殖水體的pH 變化范圍為6.8～8.5[24]，可見該菌的發酵產物在淡水養殖水體中也具有較好的酸堿適應性。本試驗為進一步研究開發水霉病生防菌劑提供了優質菌種資源和基礎研究數據，后續試驗還將對該菌株的安全性及防治效果進行測定，以期為該菌開發為新型生物菌劑奠定基礎。