環境因子對克氏原螯蝦Procambarus clarkii 免疫指標影響的研究進展

舒斌，李軍濤，張秀霞，冼健安，周小云，王冬梅

（1.華中農業大學水產學院，湖北 武漢 430070；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南 海口 571101；3.海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，海南 海口 571101）

克氏原螯蝦Procambarus clarkia（俗稱淡水小龍蝦）原產于墨西哥東北部和美國中南部，引入到日本后20 世紀30 年代由日本傳入我國。我國克氏原螯蝦養殖業發展迅猛，消費市場持續擴大，產業鏈不斷延伸，逐步形成了苗種繁殖、養殖加工、餐飲文化為一體的產業鏈。隨著養殖強度的不斷增大、水質不良，克氏原螯蝦的免疫功能下降，病害頻繁，制約了產業的健康發展。本文通過綜述環境因子對克氏原螯蝦生理生化免疫指標的影響，以期為克氏原螯蝦高效健康養殖提供參考，為進一步開展相關研究提供理論依據。

1 氨氮對克氏原螯蝦的影響

氨氮是影響克氏原螯蝦自身免疫功能的重要環境因子之一。在養殖水體中，氨氮主要來源于水產動物排泄的糞便以及水體中含氮殘餌的氨化作用，隨著養殖時間的延長，氨氮會不斷積累[1]。氨氮是NH4+（離子氨）和NH3（非離子氨）總和的統稱，NH3比NH4+對甲殼類動物的毒性更強，更容易跨越脂質雙分子層，例如水生動物的鰓絲和血液等。研究表明，氨氮首先損傷蝦類的鰓絲組織，降低其呼吸頻率，進一步滲透到血液中阻礙攜氧能力，最終導致蝦類中毒或缺氧死亡[2]。

水體中離子氨和非離子氨的比例與水溫、pH以及鹽度有關。急性毒性試驗表明，氨氮對克氏原螯蝦幼蝦的96hLC50（半致死濃度）為79.4mg·L-1[3]；對凡納濱對蝦[4]Litopenaeus vannamei 幼蝦和羅氏沼蝦[5]Macrobrachium rosenbergii 幼蝦的96hLC50分別為5.42mg·L-1和19.3mg·L-1，克氏原螯蝦幼蝦對氨氮的耐受力較強，對一定濃度范圍內，對氨氮具有自我調節能力，隨著濃度增加，毒性作用增強，對幼蝦組織器官破壞性更大，死亡率增高[3]。蘆光宇等[6]研究了不同濃度氨氮和作用時間對克氏原螯蝦免疫指標的影響。結果顯示，隨著時間的推移，所有處理組（除0mg/L 組外）肝胰腺中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性均先升高后降低。10mg·L-1、20mg·L-1組SOD 活性分別在第48h 和第36h 后下降，與對照組無顯著差異；30mg·L-1、40mg·L-1組SOD 活性均在36h 后下降，50mg·L-1組SOD活性在24 h 下降，三組均顯著低于對照組；10mg·L-1、20mg·L-1、30mg·L-1組CAT 活性在36h 無顯著差異，40mg·L-1和50mg·L-1組CAT 活性在24h 無差別，36h 顯著低于對照組；10mg·L-1組螯蝦肝胰腺中丙二醛（MDA）含量先上升，顯著高于對照組，在48 h 下降至與對照組無顯著差異，20～50mg·L-1組先上升后略微下降，但MDA 含量始終顯著高于對照組。說明氨氮脅迫開始時，螯蝦產生大量氧自由基，機體通過調節產生更多的SOD 和CAT 消除多余的氧自由基，但隨著氨氮濃度的升高，產生的氧自由基超出了機體清除能力，導致抗氧化能力減弱。劉振興[7]研究發現，在5mg·L-1NH+4-N（銨態氮）脅迫1～96h 期間，克氏原螯蝦血細胞總數（THCs）和酚氧化酶（PO）、SOD 活性以及鰓絲Na+-K+-ATPase活性均先上升后降低，在15 mg·L-1、30 mg·L-1和50 mg·L-1組這些免疫指標均被抑制。綜上所述，克氏原螯蝦抵抗氨氮脅迫有一定范圍，在一定的低濃度下，氨氮的脅迫會迅速激活蝦體相關抗氧化酶的活性，消除脅迫產生的大量活性氧自由基，而長時間高濃度的氨氮可能會損傷蝦體組織器官，破壞免疫系統，生理生化指標出現下降。

2 亞硝酸鹽對克氏原螯蝦的影響

亞硝酸鹽也是克氏原螯蝦重要的環境脅迫因子之一，亞硝酸鹽過高往往能引發蝦類發生一系列的疾病。水體中的硝化細菌通過硝化作用將NH+4（銨根離子）氧化或者通過硝酸鹽反硝化作用還原成亞硝酸鹽。亞硝酸鹽毒性很強，能抑制一些抗氧化酶的活性，導致蝦類組織器官的病變。鐘君偉等[8]研究發現，以12.32mg·L-1，并進一步12mg·L-1的亞硝酸鹽氮脅迫處理體質量（9.32±1.57）g 的克氏原螯蝦，24 h 后肝胰腺中SOD 活性迅速降低（P＜0.05），明顯低于對照組（0mg·L-1），且隨時間延長SOD 活性抑制程度更大（P＜0.05），72h 抑制程度最高為37.77%，CAT 活性在脅迫12h 就迅速降低（P＜0.05），24h 時抑制程度達到最高。綜上所述，亞硝酸鹽能影響克氏原螯蝦的免疫功能，CAT 對亞硝酸鹽脅迫時的反應迅速，比SOD 更加敏感，更早地受到抑制。6 組不同濃度亞硝酸鹽對克氏原螯蝦脅迫后，不同時間取肝胰腺檢測，發現SOD、CAT 活性和MDA 含量隨時間延長先上升后下降；選取同個時間點檢測不同濃度梯度的亞硝酸鹽，肝胰腺中SOD 和CAT 活性隨亞硝酸氮濃度升高先上升后下降，而MDA 含量均逐漸上升[9]。亞硝酸鹽能進入甲殼動物血淋巴中將氧合血藍蛋白轉化成脫氧血藍蛋白，使其失去運輸氧氣的功能，導致動物缺氧死亡。目前關于亞硝酸鹽對甲殼動物血藍蛋白研究較少。對日本沼蝦Macrobranchium nipponense 的研究發現，隨亞硝酸鹽質量濃度增加，血淋巴中血藍蛋白含量先上升后下降，2.0 mg·L-1時血藍蛋白含量最高，與對照組差異顯著（P＜0.05），隨濃度增加，降低到與對照組無顯著差異[10]。

3 pH 對克氏原螯蝦的影響

pH 變化對水生動物、浮游植物以及底棲動物的生長發育也有直接或者間接的影響。倪靜靜等[11]研究了pH5.5、6.5、純水（對照組6.7）、7.5 和8.0 對克氏原螯蝦的影響，發現pH5.5 和pH8.0 下克氏原螯蝦在一周內死亡率較多。幼蝦對pH 變化的耐受力比成蝦更低[12，13]。Na+-K+-ATPase 對外界環境的變化很敏感，可以作為衡量甲殼動物生理狀況的指標[14]。研究發現，pH5.0 和pH9.0 時，克氏原螯蝦鰓組織Na+-K+-ATPase 活力顯著低于對照組（pH7.0），而pH 9.0 組該酶的活力顯著高于pH5.0，說明酸性條件下堿性對克氏原螯蝦酶活力的抑制作用更強[15]。這是由于鰓上皮細胞頂部膜上的Na+/H+體系，在H+濃度過高時，吸收外界Na+能力下降，導致與交換體系偶聯的Na+-K+-ATPase 活性降低[16]。熊傳喜等[17]發現，在pH3.0～7.0 時克氏原螯蝦PO 活性隨pH 升高而增加，當pH＞7 后，酶活力隨pH 升高而降低，血清PO 在pH6.0 和7.0 的緩沖體系中穩定性較強，在30℃下保溫30 min 后PO 活力仍然保持原活力的96%和81%。朱毅菲[18]研究了低pH2.0、4.0、6.0對克氏原螯蝦免疫功能的影響。結果表明，持續酸性溶液作用下，螯蝦肝胰臟和肌肉溶菌酶（LSZ）、PO、SOD、THCs 以及螯蝦對金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus 的吞噬活性和清除效率下降趨勢明顯，低pH 的酸性溶液能使克氏原螯蝦的免疫能力顯著下降（P＜0.05），建議克氏原螯蝦養殖水體的pH 維持在6.0 以上。陶易凡等[19]用高pH10.2脅迫克氏原螯蝦96h 后，發現鰓絲Na+-K+-ATPase活性呈上升趨勢，8 h 后與對照組（pH7.6）差異顯著，肝胰腺中CAT 活性先上升后下降，SOD 活性初始沒有明顯變化，24h 后明顯下降；低pH3.6 在96h期間，克氏原螯蝦鰓絲Na+-K+-ATPase 活性上升，2h 內與對照組（pH7.6）無差異，脅迫8h 后顯著高于對照組；脅迫2h SOD 活性與對照組差異顯著，8h 活力達到最大隨后下降，96h 后顯著低于對照組，CAT活性呈先上升后下降的趨勢，但變化規律與SOD 不同步，脅迫2h 后CAT 活性與對照組無差異，8h 才開始顯著高于對照組，96h 后試驗組CAT 活力與對照組差異不顯著[20]。綜上所述，當pH 突變克氏原螯蝦通過鰓絲Na+-K+-ATPase 活性上升調節自身滲透適應力，維持體內離子平衡。pH 刺激使鰓組織離子通透性異常，Na+-K+-ATPase 活性上升有助于維持鰓的離子交換平衡；肝胰腺抗氧化能力的SOD 和CAT 活性一開始上升，可能是由于pH 的刺激導致螯蝦體內活性氧自由基的大量產生，激活了機體抗氧化酶的活力，加速了清理自由基的能力，后期活性氧自由基過度累積，超出了抗氧化系統的清理能力，細胞受到氧化損傷，抑制了肝胰腺抗氧化功能。

4 溶解氧對克氏原螯蝦的影響

氧氣是水生生物生存的必要條件，蝦池中溶解氧含量直接影響螯蝦呼吸頻率和代謝強度。病原、環境、養殖對象相互作用和影響共同決定是否爆發疾病。溶解氧對三者的影響非常重要，充足的溶解氧能夠優化水質減少病原生物，提高水生動物的免疫力。低溶解氧量已經成為螯蝦發病的重要誘因之一。隨著水體中溶解氧含量的降低，甲殼動物THCs不斷下降，對病原的易感性增強[21]。窒息點是水生動物窒息臨界含氧量，是所能忍受低氧的下限指標。克氏原螯蝦窒息點可低至0.061 mg·L-1[22]，羅氏沼蝦窒息點最低為0.960 mg·L-1[23]，南美白對蝦窒息點最低為0.666 mg·L-1[24]。克氏原螯蝦對水體低溶解氧量的耐受能力比較強。為了探究溶解氧量對羅氏沼蝦免疫能力的影響，Cheng 等研究發現，羅氏沼蝦在低溶解氧情況下THCs 下降、PO 活力降低，對腸球菌Enterococcus 的吞噬能力和清除能力也顯著減弱[25]。中國明對蝦Fenneropenaeus chinensis 在2.0 mg·L-1低溶氧脅迫下具有一定耐受性和調節能力，在6h 和12h 對蝦血漿和肌肉中乳酸含量顯著增加，24h 后降到對照組水平，對鰓及肝胰臟中抗超氧陰離子活力以及MDA 無顯著影響[26]。凡納濱對蝦在低溶解氧含量下血漿PO 活力在0～12h 內呈上升趨勢，12h 后趨于穩定，且溶解氧含量越低酶活力越高，鰓絲Na+-K+-ATPase 活力在0～12h 內呈升高趨勢，12h 酶活力最大，溶解氧含量越低酶活力越高，此后開始下降，48h 后趨于穩定，穩定后與對照無顯著差異[27]。水體溶解氧對克氏原螯蝦免疫功能、生理生化指標的影響報道較少，有待深入研究。

5 溫度對克氏原螯蝦的影響

克氏原螯蝦的最適生長溫度為21～28℃，水溫12℃以下停止攝食，超過30℃鉆進洞穴[28]。生產中發現，水溫的劇烈變化是引起螯蝦死亡的重要因素。熊傳喜等[17]發現，在20～70℃范圍內，克氏原螯蝦血清PO 酶活力的最適溫度為20℃，隨溫度升高酶活力迅速下降，20～40℃時PO 活力較為穩定。水生動物Na+-K+-ATPase 對溫度較敏感，能在短時間內迅速對不良環境起免疫應答反應。郭春雨等[15]發現，在15℃、20℃和30℃下，克氏原螯蝦鰓絲Na+-K+-ATPase 活力隨溫度升高而升高，在溫度突變后的短時間內該酶活力迅速上升，表現出很強的應激反應，4h 后酶的比活力逐漸下降，適應新的溫度。溫度通過直接影響生物膜結構來影響蝦鰓絲的Na+-K+-ATPase 活力，膜上構象的轉變和酶對底物親和力的提高，使鰓絲Na+-K+-ATPase 對血淋巴滲透壓調節的能力加強[29]。說明克氏原螯蝦對溫度的變化在一定范圍內具有自我調節的功能，在溫度脅迫下能迅速作出防御反應。酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）參與甲殼動物的磷酸基團代謝和轉運，能夠形成水解酶，清除入侵機體的異物[30，31]。王天神等[32]研究發現，在水溫10～15℃時，克氏原螯蝦血液中ACP、AKP 活性穩定，20℃兩者活性達到最大值，隨著水溫繼續升高活性逐漸下降；CAT 活性在10～30℃隨溫度升高逐漸降低，10℃時活性最高，30℃時最低；SOD 活性在10℃最低，在10～30℃范圍內隨著溫度升高逐漸上升，30℃時達最高活性（138.31U·mL-1）。根據以上研究，在克氏原螯蝦養殖過程中，一定要注意水體溫度的變化，尤其是7、8月份，保持一定的水深，有利于螯蝦自身對水溫變化的調節。

6 重金屬離子對克氏原螯蝦的影響

工業廢水、農用化肥中往往存在的重金屬離子在克氏原螯蝦體內蓄積，損傷機體各個組織。研究發現克氏原螯蝦經過20d 的5 mg·L-1Cu2+、0.1mg·L-1Cd2+脅迫后，SOD 活性顯著低于對照組（P＜0.05），在各組織器官中SOD 活性由高到低順序為：肌肉＞鰓＞肝[33]。這種差異可能與重金屬離子在不同組織器官中富集能力不同有關。Cu2+在水生甲殼動物體內承擔著重要的生理作用，可以作為輔酶因子調節銅依賴酶的活性，也是合成血藍蛋白的必須物質[34]。但隨著Cu2+濃度上升，會誘導機體產生大量活性氧自由基[35]。張娟等[36]發現，在0 mg·L-1（對照組）、1 mg·L-1、3 mg·L-1、5 mg·L-1和10 mg·L-1Cu2+脅迫下，隨時間延長，各試驗組克氏原螯蝦THCs 明顯下降（P＜0.05），10 mg·L-1Cu2+組THCs 下降尤為顯著；與對照組相比PO 活性也均受到顯著抑制（P＜0.05），隨暴露時間延長1 mg·L-1和3 mg·L-1Cu2+試驗組PO 活性逐漸下降，5 mg·L-1和10 mg·L-1組活性逐漸上升，脅迫96 h 后，低濃度組（1 mg·L-1和3 mg·L-1）比高濃度組（5 mg·L-1和10 mg·L-1）影響更顯著。血藍蛋白是一種含Cu2+呼吸蛋白，結構與PO 極其相似，在一定條件下可表現出PO 活性，提高機體的抗氧化功能。張娟[37]發現，1 mg·L-1組脅迫24 h，克氏原螯蝦血藍蛋白含量顯著高于對照組，當Cu2+濃度高于3.0 mg·L-1時，血藍蛋白含量均低于對照組；將克氏原螯蝦暴露在0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1Cu2+溶液中發現，螯蝦血淋巴ROS（活性氧）先上升后被抑制[38]。這可能是重金屬Cu2+脅迫會導致螯蝦產生氧化應激，ROS 含量過高，機體抗氧化酶活性降低，螯蝦就更容易死亡。

7 病原對克氏原螯蝦的影響

環境因子中病原和藥物對克氏原螯蝦的生長及免疫功能有重要影響。嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila 普遍存在各種水體中，是養殖水體環境中主要致病菌之一。給克氏原螯蝦注射0.1 mL 濃度為1.5×104cfu·mL-1、1.5×106cfu·mL-1嗜水氣單胞菌作后，THCs 含量和SOD 活性均先降低后上升，低濃度組在1～96h 溶菌活性、抗菌活性、PO 活性均先上升后降低，高濃度組溶菌活性、抗菌活性、PO 活性則被抑制，均先降低后上升，但仍低于對照組[39]。作為細菌敗血癥病原的嗜水氣單胞菌，一旦感染，將引起克氏原螯蝦免疫功能下降，因此要合理控制密度健康養殖。李賀水等[40]以胰蛋白酶作誘導劑，激活酚氧化酶原，發揮PO 活力，發現在大腸桿菌注射試驗中無論是否加胰蛋白酶，試驗組與對照組血細胞PO 活力均無明顯差異；在嗜水氣單胞菌注射實驗中，無論是否加胰蛋白酶，肝胰臟和血細胞PO活力在12h、24h、48h 顯著高于對照組。可見克氏原螯蝦對致病菌嗜水氣單胞菌與非致病菌大腸桿菌免疫作用機制有差別。感染大腸桿菌后，血細胞中含有的結節結構能夠阻擋病原入侵，而感染嗜水氣單胞菌后沒有類似的免疫反應，病原菌入侵機體，導致死亡率增加[41]。用0.1mL 白斑綜合癥病毒（WSSV）感染克氏原螯蝦12～24 h 后，PO 活力顯著高于對照組（0.1mL PBS 緩沖液），48h 極顯著高于對照組（P＜0.01），72 h 恢復至對照組水平[40]。由此可以推測，PO 參與了克氏原螯蝦抵御WSSV 的免疫，但其作用機理還有待進一步研究。

8 研究與展望

近幾年，克氏原螯蝦產業鏈的火爆促進了該產業的發展，但是，病害的頻發制約了克氏原螯蝦的產量。甲殼動物主要通過先天性非特異性免疫系統來抵抗外來入侵異物，研究環境因子對克氏原螯蝦的影響，有利于研究病害發生的機理，為研制克氏原螯蝦抗應激作用的免疫增強劑提供新的思路。有關克氏原螯蝦的研究需進一步開展：

（1）深入探究克氏原螯蝦先天性非特異性免疫機制，從基因的角度上研究環境因子對克氏原螯蝦免疫功能的變化。

（2）結合環境因子對克氏原螯蝦的影響，制定一套高效可行的方案來評價健康蝦苗，同時開發綠色高效的免疫增強劑，從幼苗開始就提高克氏原螯蝦自身免疫力。

（3）深入探究環境因子、病原感染途徑與克氏原螯蝦三者之間的關系，結合生產實際，提高養殖產量增加創收。

（4）從單一到整體研究克氏原螯蝦對幾種環境因子免疫機制的應答，深入了解它們之間的內在關系。