以動物實驗探索內質網應激和心肺復蘇后腦損傷之間的關系

201199復旦大學附屬閔行醫院急診科，上海

對患者實施心肺復蘇(CRP)后，會引發不同程度腦損傷，具有較高致殘率和死亡率。其中主要原因是由于產生再灌注性損傷，無有效治療手段。據相關資料表明[1]，內質網應激在缺血再灌注損傷中占據重要作用，缺血預處理可讓患者內質網應激得到抑制，使非正常折疊蛋白數量減少，進而減緩腦缺血再灌注，因此為了能夠探究內質網應激和CRP 后腦損傷之間關系，本文以實驗大鼠為實驗活體，擬建立大鼠心臟驟停以及CRP模型，探討內質網應激和CRP 后腦損傷之間關系，現報告如下。

資料與方法

選取某科研院所提供的體重為300～400 g的健康雄性大鼠，大鼠在實驗前及CRP后，按照時間進行分組，分別在1 h、3 h、6 h、12 h 及24 h 等時間點進行分組，5 只/組。大鼠生命體征良好，經測試無重大疾病。在實驗前1 天禁食，可飲水。

方法：準備實驗器材以及藥劑，全套小型動物維持系統設備，包含小動物呼吸機、探針式溫度計及氣管插管、注射器等。實驗藥劑包主要有戊巴比妥鈉、肝素、腎上腺素等以及各種測定試劑盒，可以對小動物各種生命指標進行檢查。①麻醉及術前準備工作：給所有大鼠進行編號分組，并進行稱量后確定戊巴比妥鈉注射量，按照45 mg/kg 進行麻醉注射，如有中途醒來的應追加戊巴比妥鈉10 mg/kg 進行麻醉，并將大鼠麻醉后，固定于手術臺上，常規消毒器具、鋪巾等，在實驗過程中，利用加熱燈保持大鼠體溫。②氣管插管：麻醉后，使大鼠保持仰臥位并進行固定，露出頸部，逐層分離各項組織，使氣管暴露，將大鼠舌頭拉向一側，并將氣管插管插入氣管中，會感受到齒輪型阻力，深度5 cm 左右。術中大鼠會有嘔吐反射，成功后可吸去腔內黏液，避免對氣管阻塞。③心臟驟停的模型建立：為讓大鼠心臟發生驟停，本次研究采取經皮電刺激方誘發。麻醉完成后，暴露前胸，在胸骨左緣第4及右緣第3肋骨處插入無菌針灸針，當發現針灸隨心臟跳動后，則已經進入心外膜，再進針深度1 cm，完成后需要和電刺激器相連。設置參數后，誘導大鼠心臟驟停，并持續刺激3 min避免出現復跳。通過生命監測系統對大鼠血壓進行監測，血壓20 mmHg，則需停止刺激。當動脈波形消失及進行計算無干預6 min 后，開展CRP。④CRP：大鼠心臟驟停6 min后開展CRP，應立即采用呼吸機輔助通氣，氧氣濃度保持100%，頻率80 次/min，氣量0.65 mL/100 g，并進行腎上腺素推注(20 μg/kg)并用示指及中指在胸骨下進行按壓，3～4次/s，直至自主循環恢復，大鼠竇性心律，且動脈壓保持在60 mmHg長達10 min，如達不到10 min 則復蘇失敗，放棄搶救。⑤CRP 后處理：復蘇成功后，將氧氣濃度調整為正常值，根據大鼠實際情況，停止機械通氣，并在2 h后需要拔出靜脈直管以及氣管插管，將大鼠放入籠子，進行觀察，正常后開展后續實驗。

觀察指標：對各組大鼠進行腦組織海馬RNA 的提取，并對大鼠腦組織海馬內質網應激相關標記物的含量進行測定，采用Real time PCR 的方法對海馬組織內質網應激相關標記物含量進行檢測。腦組織海馬蛋白內質網應激標記物表達采用Western blot 的方法測定海馬蛋白內GRP 78、XBP-1、CHOP 和caspase 12蛋白表達量。

表1 各組大鼠于CPR后1h、24h與sham組海馬ERS標記物mRNA含量比較(μg)

表2 各組大鼠于CPR后1h、24h與sham組海馬ERS標記物蛋白含量比較(μg/L)

觀察指標：數據應用GraphPad Prism 5.0 軟件處理；所有計量數據以Mean±SEM 表示，正態分布的數據采用單因素方差分析，組間比較采用Student-Newman-Keuls 檢驗，非正態分布數據采用Mann-Whitney U 檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

各組實施CRP 后海馬ERS 標記物以及mRNA 含量比較：GRP 78、XBP-1 信使RNA含量在CRP后持續增加，GRP 78在24 h后達到峰值，含量是sham組(本次研究中sham組是假手術組，目的在于作為對照，從而進一步說明研究結果的科學性。)的2倍，XBP-1信使RNA是sham的1.67 倍，CHOP 和caspase 12 信使RNA則增加量和GRP 78、XBP-1 相比較為緩慢。而CPR 后24 h，CHOP 和caspase 12分別增加1.91 倍和1.62 倍，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

各組實施CRP 后海馬ERS 標記物蛋白質比較：在GAPSH 表達一致的情況下，在和sham 組比較后，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12 均 為 增 加量，其中CRP 進行3 h 后，GRP78、XBP-1 增加較為明顯，CHOP、caspase 12則在6 h，sham組相比，在CRP后24 h，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12分別增加1.58 倍、1.76 倍、2.13 倍、2.51 倍，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

討 論

在CRP 完成后導致腦損傷的生理功能十分復雜，過量氧自由基及氨基酸毒性損傷，病理性蛋白質和細胞內凋亡信號激活，是導致腦部損傷的主要原因。因此全身系統綜合管理具有非常重要的作用和意義，但目前雖然新藥層出不窮，但療效顯著的治療方式仍屈指可數[2-3]。所以需要采取新的研究方向，找到新的信號通路以及藥物對CPR進行改善，并對神經功能障礙方面進行的腦復蘇領域作為重點研究項目。人們已經逐步發現，ERS 反應和相關信號的傳導機制與細胞凋亡關系密切，因此內質網應激是細胞的保護機制，且ERS 厚內質網會出現大量沒有折疊的蛋白，隨時間持續，未折疊蛋白會大量聚集，使內質網功能受到影響，細胞凋亡。大量沒有折疊的蛋白質會引發各種系統功能障礙[4-5]。在本次研究中，在CRP 后24 h，GRP78、XBP-1、CHOP、caspase 12 分 別 增 加1.58倍、1.76倍、2.13倍、2.51倍，差異有統計學意義(P＜0.05)，和周東民等[6]人研究結果一致。

綜上所述，內質網應激和CRP 后腦損傷之間關系密切，但需要進一步進行研究。