二維相關(guān)光譜結(jié)合移動(dòng)窗口技術(shù)研究堆肥溶解性有機(jī)質(zhì)演化*

劉洪寶，袁 英，宋彩紅，單光春，4，虞敏達(dá)，崔 駿，何小松

（1.桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院國(guó)家環(huán)境保護(hù)地下水污染模擬與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，北京 100012；3. 聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城252000；4.哈爾濱工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090）

1 引言

隨著人口的不斷增加，有機(jī)廢物（如餐廚廢物、生活垃圾和畜禽糞便等） 的產(chǎn)生量也隨之增加，給環(huán)境造成了巨大壓力，也增加了廢物管理的成本［1］。由于具有資源化和無害化等特點(diǎn)，堆肥成為有機(jī)固體廢物處理處置的重要途徑之一［2］。工藝的優(yōu)化和產(chǎn)品的質(zhì)量決定了堆肥工藝的未來前景［3］。堆肥是一個(gè)在微生物參與下的有機(jī)質(zhì)降解和腐殖化過程，堆肥腐殖化是在微生物的作用下，可生物降解的大分子有機(jī)物（蛋白質(zhì)、有機(jī)酸和可溶性糖等） 被降解為小分子有機(jī)化合物，剩下較難分解的有機(jī)物質(zhì)（纖維素、半纖維素和木質(zhì)素） 被分解并聚合形成復(fù)雜頑固的大分子有機(jī)物質(zhì)——腐殖質(zhì)［4-5］。在此過程中，溶解性有機(jī)質(zhì)（DOM） 參與了多種生化反應(yīng)，可直接反映堆肥過程物質(zhì)轉(zhuǎn)化［6］，能更好表明堆肥物料的穩(wěn)定性［7］，是評(píng)價(jià)堆肥工藝和腐殖化程度的重要指標(biāo)。

光譜分析檢測(cè)技術(shù)具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、取樣少等優(yōu)點(diǎn)。紫外光譜、傅立葉變換紅外光譜、熒光光譜以及核磁共振光譜等光譜技術(shù)已廣泛應(yīng)用于堆肥DOM 的相關(guān)研究［8-10］。目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究往往先提取DOM，再通過光譜、波譜技術(shù)來表征其物質(zhì)組成［11］。但堆肥DOM 成分復(fù)雜，不同結(jié)構(gòu)的圖譜互相重疊，限制了進(jìn)一步解譜分析。因此，越來越多的研究者利用化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行解譜，如二維相關(guān)光譜和平行因子分析等聯(lián)合光譜學(xué)方法，研究堆肥DOM 的組成特征和轉(zhuǎn)化規(guī)律［7，12-14］。二維相關(guān)光譜將光譜擴(kuò)展到三維，能有效解決不同光譜信號(hào)的重疊問題，還可以準(zhǔn)確識(shí)別光譜信號(hào)的變化，具有揭示有機(jī)質(zhì)演替時(shí)序的功能［15-16］。然而，目前的研究主要著重于分析有機(jī)質(zhì)含量、種類等常規(guī)指標(biāo)的變化，難以解釋堆肥過程中有機(jī)質(zhì)官能團(tuán)及其核心碳骨架的演替規(guī)律，缺乏對(duì)腐殖化過程及其機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)。顯然，尋找新的或簡(jiǎn)單的方法來表征堆肥過程的物質(zhì)演變值得被高度關(guān)注。而移動(dòng)窗口技術(shù)可以觀察有機(jī)質(zhì)隨外界微擾的變化，可以確定有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵時(shí)間段［17-18］。

因此，本研究以廚余垃圾堆肥發(fā)酵為例，通過二維相關(guān)光譜和移動(dòng)窗口技術(shù)，分析堆肥過程中有機(jī)質(zhì)官能團(tuán)和碳骨架的演替規(guī)律，為堆肥物質(zhì)轉(zhuǎn)化研究和工藝調(diào)控提供參考。

2 材料和方法

2.1 堆肥過程及樣品采集

堆肥物料包括廚余垃圾10.5 kg（采集于食堂）、腐殖土9 kg（購(gòu)于花卉市場(chǎng)）、木屑0.23 kg。堆肥物料混合物C/N 為25.4、含水率為60.7%。堆肥試驗(yàn)通過室內(nèi)堆肥反應(yīng)器（容積為34 L，高40 cm，直徑33 cm） 進(jìn)行，堆肥過程通風(fēng)控制在0.5 L/（min·kg）。堆肥共持續(xù)47 d。于堆肥第0、3、6、8、13、19、35、47 天分別在反應(yīng)器中心5、15、25 cm 深處采集樣品并充分混合，以確保所采集的樣品具有代表性。堆肥樣品采集完成后立即冷凍干燥保存，并放置冰箱儲(chǔ)存于-20 ℃以備后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作（DOM 提取和分析）。

2.2 DOM 提取及制備

根據(jù)Daniel 等的方法［19］，以固體與蒸餾水之比為10（g）：100（mL） 的堆肥物料中提取DOM。將得到的懸浮液搖24 h，然后以10 000 r/min 離心10 min，上清液通過0.45 μm 濾膜過濾后收集。再將濾液冷凍干燥，用于紅外光譜（FTIR） 和13C 核磁固體共振光譜（NMR） 測(cè)試和分析。

2.3 儀器與數(shù)據(jù)分析

FTIR 使用日立EPI 紅外光譜儀，將1 g 冷凍干燥的DOM 樣品與300 g 干燥KBr 混合，然后將混合物在10 000 kPa 下壓2 min，再以2 cm-1分辨率從4 000 cm-1到400 cm-1進(jìn)行掃描［20］。NMR 使用Bruker 型AV-300 型光譜儀，采用頻率為12 kHz，再循環(huán)延遲時(shí)間、接觸時(shí)間和脈沖時(shí)間依次為1 s、2 000 μs 和2.4 μs［20］。

二維相關(guān)光譜（2DCOS） 是一種將光譜強(qiáng)度與外界干擾看作兩個(gè)獨(dú)立變量函數(shù)的技術(shù)，將二維相關(guān)分析引入光譜研究，可提高光譜的分辨率和重疊峰的分離度［17］。使用2D Shige 版本1.3 軟件（Kwansei-Gakuin 大學(xué)，日本） 進(jìn)行二維相關(guān)光譜和移動(dòng)窗口分析，該軟件是在廣義二維相關(guān)分析理論的基礎(chǔ)上開發(fā)出來的，對(duì)于該軟件采用的算法Noda 和Ozaki 進(jìn)行了詳細(xì)描述［15］。以堆肥時(shí)間作為外部擾動(dòng)，得到了一組隨時(shí)間變化的FTIR和NMR 二維相關(guān)光譜的同步圖和異步圖。此外，對(duì)FTIR、NMR 數(shù)據(jù)采用移動(dòng)窗口技術(shù)分析，移動(dòng)窗口分析基本思路是，每次從所有樣本中取出一部分進(jìn)行分析，然后將“窗口”進(jìn)行移動(dòng)，再取另外一部分樣本進(jìn)行分析，得到整體中各個(gè)部分的局部信息，它不僅可跟蹤反映某一官能團(tuán)隨微擾的改變，還能更清晰揭示出兩個(gè)官能團(tuán)之間隨微擾變化的規(guī)律［21-22］，移動(dòng)窗口技術(shù)詳細(xì)分析計(jì)算過程見文獻(xiàn)［17］。最后使用origin 8.0 進(jìn)行圖譜繪制。

3 結(jié)果與討論

3.1 堆肥過程中有機(jī)質(zhì)官能團(tuán)演替特征

利用紅外光譜結(jié)合二維相關(guān)光譜研究堆肥過程中DOM 的組成和演變規(guī)律。圖1 為堆肥過程中DOM 紅外光譜經(jīng)二維相關(guān)分析得到的同步和異步圖。同步圖中包括自相關(guān)峰和交叉峰，對(duì)角線上的峰為自相關(guān)峰，對(duì)角線外的為交叉峰［23］。在同步圖中出現(xiàn)了6 個(gè)自相關(guān)峰，分別在3 350/3 350、2 890/2 890、1 730/1 730、1 650/1 650、1 260/1 260、650/650 cm-1處，其強(qiáng)度依次為1 650/1 650 cm-1＞1 730/1730cm-1＞1260/1260cm-1＞3 350/3 350 cm-1＞2 890/2 890 cm-1＞650/650 cm-1。各紅外光譜對(duì)應(yīng)波段的歸屬如下［20，24-26］：在3 350 cm-1源于酚基的O H 伸縮振動(dòng)，2 890 cm-1源于脂肪甲基或亞甲基C H 伸展振動(dòng)，1 730 cm-1為羧基O C＝O振動(dòng)，1 650 cm-1歸因于蛋白質(zhì)酰胺基的C＝O，1 260 cm-1是由醇、酯、醚及羧酸的C O 伸縮引起的，而650 cm-1歸因于胺的C H 或N H非平面振動(dòng)。同時(shí)，在3 350/2 890、3 350/1 730、3 350/1 650、3 350/1 260、1 650/1 260、1 650/650、1 260/650 cm-1處出現(xiàn)正交叉峰，這7 個(gè)正交叉峰的存在表明堆肥過程脂肪、蛋白質(zhì)、多糖以及醇、酯、醚等轉(zhuǎn)化方向一致。此外，還存在3 個(gè)負(fù)交叉峰：1 730/1 260、1 730/650、2 350/1 730 cm-1，2 350 cm-1為C C 或C＝N 拉伸［14］，以上結(jié)果顯示堆肥過程中羧基與胺、酰胺轉(zhuǎn)化方向不一致，可能堆肥過程羧基等結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水，而在此時(shí)酰胺和胺結(jié)構(gòu)可能與木質(zhì)素酚等形成了腐殖質(zhì)。

與同步圖相比，在二維紅外相關(guān)光譜的異步圖中只檢測(cè)到交叉峰。如圖1（b） 所示，有7 個(gè)主要的負(fù)交叉峰（3 350/650、3 350/1 260、3 350/1 650、3350/2890、1650/650、1650/1260、1260/650 cm-）1，和3 個(gè)主要的正交叉峰（2 890/650、2 890/1 250、2 890/1 650 cm-）1。根據(jù)Noda 規(guī)則［15］，可以推斷出堆肥過程不同官能團(tuán)的變化時(shí)序?yàn)? 890 cm-1＞650 cm-1＞1 260cm-1＞1 650 cm-1＞3 350 cm-1，即堆肥過程有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)序?yàn)椋褐悺贰肌Ⅴァ⒚选鞍最悺举|(zhì)素酚。

圖1 二維紅外相關(guān)光譜

為了進(jìn)一步確定堆肥過程中有機(jī)質(zhì)官能團(tuán)轉(zhuǎn)化關(guān)鍵階段，引入了移動(dòng)窗口技術(shù)［17］，結(jié)果如圖2 所示。從圖2 可以看到，堆肥初期的第3 天，在1 260 cm-1和1 650 cm-1處出現(xiàn)弱的紅外光譜峰，說明堆肥的第3 天，醇、酯、醚和蛋白類發(fā)生了降解和轉(zhuǎn)化，這與此階段處于升溫末期，微生物活動(dòng)將可生物降解的有機(jī)物降解為小分子有機(jī)化合物有關(guān)［20，27］，因此第3 天可能是物質(zhì)變化明顯的時(shí)間拐點(diǎn)。隨后處于高溫期，微生物活動(dòng)受到抑制，有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化緩慢。同時(shí)可觀察到，堆肥腐熟期（第13～35 天） 在650、1 260、1 650、1 840、2 890、3 350 cm-1處出現(xiàn)紅外光譜峰，峰的強(qiáng)度變化為1 650 cm-1＞1 260、1 840 cm-1＞2 890、3 350 cm-1＞650 cm-1，說明第13～35 天蛋白質(zhì)、醇、酯、醚、脂類、胺均發(fā)生了顯著變化，而胺僅在第13～35 天觀察到變化，可能由于蛋白質(zhì)類化合物降解慢于脂類物質(zhì)，初期胺類物質(zhì)降解緩慢［28］，這也說明了移動(dòng)窗口技術(shù)能揭示物質(zhì)隨時(shí)間擾動(dòng)而發(fā)生顯著變化。此外，發(fā)現(xiàn)堆肥發(fā)酵的第19 天，1 500、1 840 cm-1處出現(xiàn)了紅外光譜峰，這與木質(zhì)纖維素和酰胺相關(guān)，意味著這一階段可能發(fā)生木質(zhì)纖維素與酰胺聚合形成了腐殖質(zhì)類物質(zhì)。綜上分析表明，在堆肥過程中第3 天和第13天是物質(zhì)轉(zhuǎn)化明顯的時(shí)間點(diǎn)，堆肥后期（第13～35天） 物質(zhì)轉(zhuǎn)化明顯，其中酰胺基和酚羥基變化最為明顯，可能與這一階段處于堆肥腐熟期，腐殖質(zhì)大量形成有關(guān)［29］。

圖2 移動(dòng)窗口紅外光譜

3.2 堆肥過程中有機(jī)質(zhì)碳骨架演替規(guī)律

核磁共振光譜可提供碳骨架的相關(guān)信息，常被用于有機(jī)質(zhì)碳骨架的研究［6，20］。如圖3（a） 所示，在二維核磁共振相關(guān)譜中檢測(cè)到5 個(gè)自相關(guān)峰，分別為170/170 δ、128/128 δ、70/70 δ、55/55 δ、30/30 δ，各峰的強(qiáng)度順序?yàn)椋?0/30 δ＞170/170 δ＞128/128 δ＞55/55 δ＞70/70 δ。根據(jù)前人研究報(bào)道［20，30-32］，30 δ 為CCH2、55 δ 為NCH 或OCH3、70 δ 為OCH、128 δ 為芳香碳，170 δ 為COO 和N C＝O。因此，上述結(jié)果表明有機(jī)碳的敏感度為：CCH2＞COO 和N C＝O ＞芳香碳＞NCH 或OCH ＞OCH3，這是由于微生物優(yōu)先利用易降解物質(zhì)如小分子糖類、蛋白質(zhì)等進(jìn)行快速生長(zhǎng)和繁殖［33］。另外，根據(jù)圖3（a） 所檢測(cè)到的正交叉峰，表明核磁共振光譜中30 δ、55 δ、70 δ、128 δ、170 δ 的峰呈正相關(guān)，說明在堆肥過程中酰胺、芳香碳、多糖轉(zhuǎn)化方向一致，即均發(fā)生降解。

異步圖如圖3 （b） 所示，在55/30 δ、128/28 δ、 128/30 δ、 128/70 δ、 150/30 δ、175/30δ 附近有6 個(gè)主要正交叉峰，同時(shí)在30/28δ和30/25 δ 附近出現(xiàn)2 個(gè)負(fù)交叉峰，根據(jù)先前研究報(bào)道［34］，25 δ 為CCH3，28 δ 為CCH2，因此說明CCH3變化/降解比CCH2慢。根據(jù)Noda 規(guī)則［15］，堆肥過程中峰的變化順序?yàn)椋?75δ、150δ、128 δ 和55 δ ＞28 δ 和25 δ＞30 δ。因此，堆肥過程中有機(jī)碳的轉(zhuǎn)化時(shí)序?yàn)椋乎０贰⒍嗵恰谆鷣喖谆Ｓ捎谕榛冀Y(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，部分烷基碳在堆肥過程中可以被微生物用作碳源消耗，而穩(wěn)定性較好的烷基則作為腐植酸的組分發(fā)揮其功能［31］。

圖3 二維核磁共振相關(guān)光譜

采用移動(dòng)窗口技術(shù)來進(jìn)一步揭示堆肥過程中有機(jī)質(zhì)碳骨架的階段性變化，結(jié)果如圖4 所示，可看到堆肥初期的第3～6 天，在175 δ、128 δ、55δ、30δ 處出現(xiàn)核磁波譜峰，說明羧基、酰胺基、芳香基或者OCH3以及亞甲基發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化，此時(shí)間段為有機(jī)質(zhì)碳骨架變化明顯的時(shí)間段，這與上述官能團(tuán)變化的時(shí)間不太吻合，可能由于有機(jī)質(zhì)被降解的同時(shí)產(chǎn)生大量熱能，堆肥物料溫度快速升高從而引起碳結(jié)構(gòu)變化［27］。根據(jù)Yuan 等［20］報(bào)道此時(shí)堆體溫度近乎達(dá)到68 ℃。有機(jī)物物質(zhì)的變化可能并未引起有機(jī)碳結(jié)構(gòu)的變化，堆肥前期溶解性有機(jī)物物質(zhì)結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定，易于被降解或發(fā)生構(gòu)象變化［20］。隨著堆肥的進(jìn)行，在堆肥第19～35天175 δ、128 δ、55 δ、30 δ 處也出現(xiàn)波譜峰，峰的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?0 δ＞175 δ＞128 δ＞55 δ，其所對(duì)應(yīng)的碳骨架均發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，表明第19～35天是有機(jī)質(zhì)碳骨架變化明顯的時(shí)間段。另外，與第3～6 天相比，第19～35 天的NCH 或OCH3、COO 和N C＝O、CCH2的碳骨架變化增強(qiáng)，而芳香碳骨架的變化減弱。此階段處于堆肥腐熟期，隨著堆肥進(jìn)行，易降解的多糖類小分子物質(zhì)和脂肪族含量減少，芳香性增強(qiáng)，從而形成穩(wěn)定的芳香碳骨架［21］。綜上分析，表明在堆肥過程中，第3～6 天和第19～35 天是有機(jī)質(zhì)碳骨架演變明顯的時(shí)間段，其中CCH2的碳骨架變化在兩時(shí)間段最為明顯。

圖4 移動(dòng)窗口核磁共振光譜

二維異質(zhì)相關(guān)光譜常被用于檢測(cè)兩種不同光譜的共變特征［18］。正相關(guān)說明兩種不同光譜強(qiáng)度變化一致或存在相似來源。為了進(jìn)一步研究堆肥過程中有機(jī)質(zhì)官能團(tuán)與有機(jī)碳結(jié)構(gòu)的關(guān)聯(lián)，得到了NMR 和FTIR 光譜之間的異質(zhì)二維相關(guān)光譜圖。如圖5（a） 所示：在25 δ、50 δ、125 δ 與1 300 cm-1附近觀察到3 個(gè)較明顯的正相關(guān)峰，表明CCH3（25 δ）、NCH 或OCH3（50 δ）、芳香碳（125 δ）與醇類、酯類、醚類及羧酸物質(zhì)（1 300 cm-1） 有相似來源［35］。另外在30 δ、50 δ、75 δ、125 δ、170 δ 與1 840 cm-1存在的5 個(gè)正相關(guān)峰，表明CCH2（30 δ）、NCH 或者OCH3（50 δ）、OCH（75δ）、芳香碳（125δ）、COO和N C＝O（170δ）與蛋白質(zhì)酰胺基的C＝O（1 840 cm-1） 有著相似的來源。同時(shí)在125 δ 與3 350 cm-1附近的正相關(guān)峰，說明芳香碳（125 δ） 與酚基（3 350 cm-1） 有相似來源。以上分析表明，醇類、酯類、醚類及羧酸類物質(zhì)，蛋白質(zhì)酰胺類物質(zhì)和酚基類物質(zhì)存在相同的物質(zhì)中，即可能發(fā)生了腐殖化形成了腐殖質(zhì)。在圖5（b）異步圖，可看到25δ、50δ、125 δ與1 300 cm-1附近觀察到的正相關(guān)峰，表明醇類、酯類、醚類及羧酸物質(zhì)（1 300 cm-1） 比CCH3（25 δ）、NCH 或OCH3（55 δ）、芳香碳（125 δ）優(yōu)先變化。同時(shí)30 δ、50 δ、75 δ、125δ、170δ與1 840 cm-1存在的負(fù)相關(guān)峰，表明蛋白質(zhì)酰胺基C ＝O 的變化慢于CCH2（30 δ）、NCH 或 者OCH3（50 δ）、OCH（75 δ）、芳香碳（125 δ）、COO 和N C＝O（170 δ）。另外3 350 cm-1與125 δ 附近的正相關(guān)峰，表明酚基（3 350 cm-1）比芳香碳（125 δ） 優(yōu)先變化。以上分析表明，醇類、酯類、醚類及羧酸類物質(zhì)，蛋白質(zhì)酰胺類物質(zhì)和酚基類物質(zhì)具有較高的芳香性和共軛鍵官能團(tuán)。

圖5 二維FIRT/NMR 異質(zhì)相關(guān)光譜圖

4 結(jié)論

二維紅外相關(guān)光譜和移動(dòng)窗口分析表明，有機(jī)質(zhì)官能團(tuán)降解順序?yàn)椋褐悺贰肌Ⅴァ⒚选鞍最悺举|(zhì)素酚，在堆肥后期（第19～35天） 酰胺基的C＝O 或芳香環(huán)C＝C 演變最為明顯，意味著這一時(shí)期可能發(fā)生腐殖化形成了腐殖質(zhì)。二維核磁共振波譜顯示，有機(jī)碳骨架的降解順序?yàn)镃OO 和N C＝O、NCH 或OCH3→CCH3→CCH2。再結(jié)合移動(dòng)窗口分析表明堆肥高溫期（第3～6 天） 和腐熟期（第13～19 天） 碳骨架（NCH或OCH3、COO 和N C＝O、CCH2） 演變明顯，其中CCH2最為明顯。基于以上對(duì)有機(jī)質(zhì)分子層面結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化規(guī)律認(rèn)識(shí)，可知在堆肥升溫末期和腐熟期有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化劇烈，后續(xù)研究可考慮控溫、接種微生物以改善堆肥過程中的生化特性。例如，在升溫期可人為適當(dāng)提高溫度或延長(zhǎng)升溫期以縮短堆肥周期、提高堆肥腐殖化效率，或者適當(dāng)添加嗜熱微生物以加速有機(jī)質(zhì)降解。本研究揭示了堆肥過程物質(zhì)轉(zhuǎn)化特征和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，為餐廚垃圾處理設(shè)備的調(diào)控與優(yōu)化提供參考，進(jìn)而提高餐廚垃圾處理效率，降低其環(huán)境衛(wèi)生危害。