電針對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及p-GSK-3β、GLUT1蛋白表達(dá)的影響*

孟曉鵬,楊 歡,王瑞輝

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)為神經(jīng)外科最常見(jiàn)的腦部創(chuàng)傷性疾病[1-2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)根據(jù)本病發(fā)作時(shí)間將其分為原發(fā)性顱腦損傷和繼發(fā)性顱腦損傷兩大類[3]，前者是由機(jī)械力引起腦組織的直接破壞；后者是原發(fā)性損傷后在損傷局部和周圍出現(xiàn)的組織和細(xì)胞的病理生理變化，包括神經(jīng)細(xì)胞的缺血缺氧、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、炎癥反應(yīng)、繼發(fā)感染及細(xì)胞凋亡等一系列變化[4-5]。在上述病理生理變化過(guò)程中，均可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡是神經(jīng)細(xì)胞死亡的一種形式，TBI后細(xì)胞凋亡的發(fā)生是由于繼發(fā)性病理生理改變激活神經(jīng)細(xì)胞的膜信號(hào)系統(tǒng),使調(diào)控細(xì)胞凋亡的程序基因被啟動(dòng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞程序性的自我破壞或死亡[6-7]，引起一系列神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。現(xiàn)代研究表明針灸療法對(duì)TBI的治療具有確切的療效，臨床研究顯示，電針療法對(duì)重型TBI患者促醒作用及改善患者后遺癥期肢體運(yùn)動(dòng)功能等都具有顯著的效果[8-10]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)針刺可以使TBI后腦組織損傷區(qū)域細(xì)胞膜的穩(wěn)定性得到改善，減輕腦水腫的發(fā)生，提高腦細(xì)胞對(duì)氧的攝取能力，減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11-14]。本實(shí)驗(yàn)從電針對(duì)TBI大鼠腦組織細(xì)胞凋亡以及p-GSK-3β及GLUT1表達(dá)的影響，探索電針治療本病的部分效應(yīng)機(jī)制，為針灸治療本病的臨床推廣提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 從成都達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)進(jìn)76只SPF級(jí)6周齡SD雄性大鼠，體重200±20 g，許可證編號(hào)：SCXK(川)2015-30，本次實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守《國(guó)家醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定進(jìn)行飼養(yǎng)及處理。于陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研中心動(dòng)物房進(jìn)行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后隨機(jī)選取60只大鼠進(jìn)行TBI造模，預(yù)留空白組和假手術(shù)組各8只，造模過(guò)程中死亡6只，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和針刺組各27只，在造模后3、7、14 d每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取9只進(jìn)行取材檢測(cè)。

2 主要試劑及儀器 免疫組化試劑盒：邁新生物公司(福州)，批號(hào)：Kit-9902；一步法TUNEL試劑盒：碧云天生物技術(shù)公司(上海)，批號(hào)：C1086；蘇木-伊紅染色試劑盒：北京索萊寶科技公司，批號(hào)：G1120；DAB顯色試劑盒：邁新生物公司(福州)，批號(hào)：DAB-0031；p-GSK-3β(Ser9)抗體：Cell Signaling Technology，批號(hào)：#9323；GLUT1抗體：美國(guó)Novus公司，批號(hào)：NB110-39113。腦立體定位儀：金洋萬(wàn)達(dá)科技公司(北京)，型號(hào)：ST-3ND；微型磨鉆：浩峰儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：P16011A。

3 動(dòng)物模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于造模前8 h禁水禁食，采用改良Feeney’s自由落體打擊法制備TBI模型[15]。用2%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉(0.2 ml/100 g)，待麻醉生效后在大鼠頭正中線中點(diǎn)左側(cè)0.5 cm處切開(kāi)1.5 cm切口，用微型磨鉆在冠狀縫后6 mm，矢狀縫左側(cè)旁開(kāi)4 mm處開(kāi)一直徑為5 mm的骨窗，將打擊頭放在骨窗上，選用20 g砝碼從高為35 cm的透明玻璃管中垂直下落撞擊打擊頭的尾部，造成左腦頂葉損傷，常規(guī)消毒后進(jìn)行外科縫合，單籠常規(guī)喂養(yǎng)。術(shù)后每天腹腔注射硫酸慶大霉素0.5 mg/100 g，連續(xù)治療7 d，預(yù)防術(shù)后感染的發(fā)生；假手術(shù)組SD大鼠只進(jìn)行開(kāi)顱，不打擊，具體手術(shù)方法同模型組及針刺組，術(shù)后常規(guī)給予抗感染治療；空白組不做任何處理。

4 電針干預(yù)方案 造模后1 d開(kāi)始對(duì)針刺組大鼠電針治療，穴位選“百會(huì)、水溝”及患側(cè)“內(nèi)關(guān)及足三里”，針具選取華佗牌一次性針灸針(0.25×25 mm)，穴位定位及操作[16]：水溝直刺2 mm，行提插捻轉(zhuǎn)20 s后不留針；百會(huì)向前平刺5 mm；內(nèi)關(guān)斜刺5 mm，足三里斜刺10 mm。在內(nèi)關(guān)和足三里進(jìn)行電針治療，采用2 Hz斷續(xù)波，15 min/次，1次/d，連續(xù)治療14 d，其余各組不予干預(yù)。

5 實(shí)驗(yàn)取材及檢測(cè)方法 模型組和針刺組于造模后3、7、14 d分批進(jìn)行取材，每次取9只；空白組和假手術(shù)組于造模后14 d統(tǒng)一取材，每組8只。用2%戊巴比妥鈉(0.2 ml/100 g)腹腔注射麻醉后開(kāi)胸，暴露心臟，用輸液器于心尖部穿刺后進(jìn)行冰生理鹽水灌注，待全身血液被沖出體外后，快速斷頭取腦，將取出的腦組織放入冰4%多聚甲醛中固定，不超過(guò)24 h，固定結(jié)束后進(jìn)行組織脫水及包埋，后期進(jìn)行石蠟包埋切片。

5.1 HE染色：染色前將石蠟切片常規(guī)脫蠟；脫蠟完成后依次按照以下順序進(jìn)行染色：蘇木素染色5 min，純水洗3 min，伊紅染色1 min，純水洗1 min，分化液分化10 s；染色完成后對(duì)組織進(jìn)行梯度乙醇脫水及二甲苯透明；再用中性樹(shù)膠封片。

5.2 細(xì)胞凋亡:石蠟切片常規(guī)脫蠟；脫蠟完成后在每個(gè)組織上滴加20 μg/ml的不含DNase的蛋白酶K，37 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min，PBS洗滌5 min×3次；然后在每個(gè)樣品上滴加配置好的tunel檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌5 min×3次；用抗熒光淬滅液進(jìn)行封片后顯微鏡下觀察并拍照。

5.3 免疫組化：石蠟切片常規(guī)脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)；完成后加3%過(guò)氧化物酶阻斷劑反應(yīng)，PBS清洗后用再進(jìn)行封閉，加一抗溶液4 ℃過(guò)夜；次日復(fù)溫后依次加反應(yīng)增強(qiáng)液及聚合物；最后進(jìn)行DAB顯色；最后進(jìn)行蘇木素染核，染色完成后對(duì)組織進(jìn)行梯度乙醇脫水及二甲苯透明，結(jié)束后用中性樹(shù)膠封片。

結(jié) 果

1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果 空白組和假手術(shù)組大鼠腦組織HE染色可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，輪廓清楚，染色均勻，無(wú)組織細(xì)胞水腫及壞死；針刺組及模型組大鼠腦組織在術(shù)后3 d出現(xiàn)不同程度的壞死空洞區(qū)、腦組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)異常，細(xì)胞水腫及細(xì)胞碎裂等表現(xiàn)；但隨著時(shí)間的推移，在術(shù)后7、14 d針刺組大鼠腦組織的病灶范圍逐漸縮小，腦組織水腫及組織疏松逐漸減輕，損傷部位逐漸得到修復(fù)，而同時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠腦組織整體修復(fù)情況較針刺組差(圖1)。

圖1 各組大鼠腦組織情況(HE染色，×200)

2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡結(jié)果 見(jiàn)表1(圖2)。采用TUNEL法檢測(cè)各組腦組織中細(xì)胞凋亡的情況，凋亡細(xì)胞可被染成黃綠色類圓形狀，空白組和假手術(shù)組可見(jiàn)少量正常的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，造模后3 d模型和針刺組造模后可見(jiàn)大量的凋亡細(xì)胞，但隨著觀察時(shí)間的變化，7、14 d時(shí)模型組和針刺組細(xì)胞凋亡的數(shù)量逐漸減少，同時(shí)間點(diǎn)針刺組減少較模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，至造模后14 d，模型組和針刺組的凋亡數(shù)量仍較空白組和假手術(shù)組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 各組大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡(TUNEL法，×100)

表1 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)(個(gè))

3 各組大鼠腦組織中p-GSK-3β蛋白免疫組化表達(dá)結(jié)果 見(jiàn)表2(圖3)。通過(guò)免疫組化染色，可見(jiàn)p-GSK-3β蛋白的陽(yáng)性表現(xiàn)為類圓形棕褐色斑片狀，空白組和假手術(shù)組有少量p-GSK-3β蛋白陽(yáng)性表達(dá)，模型組和針刺組均存在不同程度增多的陽(yáng)性表達(dá)；與同時(shí)期模型組相比，針刺組的p-GSK-3β表達(dá)量明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；至造模后14 d，針刺組p-GSK-3β蛋白表達(dá)量與空白組、假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組p-GSK-3β蛋白的表達(dá)量與空白組、假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。

圖3 各組大鼠腦組織中p-GSK-3β的表達(dá)(免疫組化染色，×200)

表2 各組大鼠中p-GSK-3β表達(dá)平均光密度比較

4 各組大鼠腦組織中GLUT1蛋白免疫組化表達(dá)的結(jié)果 見(jiàn)表3(圖4)。空白組和假手術(shù)組腦組織中存在一定量的GLUT1蛋白的表達(dá)，且表達(dá)量相當(dāng)，調(diào)控著正常的組織代謝及細(xì)胞活動(dòng)；造模后模型組和針刺組GLUT1陽(yáng)性表達(dá)均增高，與同時(shí)間點(diǎn)模型組相比，針刺組的GLUT1陽(yáng)性表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在造模后14 d，模型組和針刺組的GLUT1蛋白的表達(dá)仍高于空白組和假手術(shù)組(P<0.01)。

表3 各組大鼠腦組織中GLUT1表達(dá)平均光密度比較

圖4 各組大鼠腦組織中GLUT1蛋白的表達(dá)(免疫組化染色，×200)

討 論

創(chuàng)傷性顱腦損傷屬于中醫(yī)學(xué)中“頭部?jī)?nèi)傷病”的范疇[17]，祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦為“奇恒之腑”，稱為“元神之府”“髓海”，陳無(wú)擇在《三因極-病證方論》中記載：“頭者，諸陽(yáng)之會(huì)……百神所聚”，可見(jiàn)頭部在全身有著重要的作用。顱腦損傷在古代屬于危急重癥，《仙授理傷續(xù)斷秘方》記載：“凡腦骨傷碎……斷然不可治矣”；清代錢文彥在《外科補(bǔ)要》中記載了“高墜下傷”“巔頂骨折”等病因病機(jī)，并指出其機(jī)理關(guān)鍵在于“血癖”[18]。所以本病的發(fā)生多為外傷導(dǎo)致腦部受損，瘀血停留，經(jīng)絡(luò)受阻。本實(shí)驗(yàn)選取百會(huì)、人中、內(nèi)關(guān)和足三里四個(gè)常用腧穴，配合電針對(duì)TBI大鼠進(jìn)行干預(yù)治療，探討電針干預(yù)對(duì)減輕TBI后的神經(jīng)功能損傷的作用機(jī)理。“百會(huì)、水溝”可以調(diào)和陰陽(yáng)，醒腦開(kāi)竅；“足三里、內(nèi)關(guān)”可以通經(jīng)活絡(luò)，調(diào)節(jié)氣血。現(xiàn)代研究也發(fā)現(xiàn)針刺百會(huì)可以明顯降低腦缺血組織缺血區(qū)NF-κB p65和Caspase-3的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19]；針刺水溝，內(nèi)關(guān)可以使缺血腦組織中PARP-1 及Caspase-3的mRNA和蛋白表達(dá)下降，改善神經(jīng)功能癥狀，從而保護(hù)神經(jīng)元[20]；針刺水溝穴也可明顯抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使神經(jīng)功能得到重建[21]。

TBI發(fā)生后其原發(fā)性損傷是無(wú)法治療的，重在預(yù)防，所以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對(duì)本病的治療方案主要是抑制創(chuàng)傷后的繼發(fā)性損傷[22]。研究證實(shí)，在TBI發(fā)生后，損傷局部會(huì)出現(xiàn)缺血缺氧的“半暗帶區(qū)”，神經(jīng)細(xì)胞的缺血缺氧會(huì)啟動(dòng)凋亡程序，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[23-24]，所以從針灸干預(yù)挽救半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞，減輕細(xì)胞凋亡是一個(gè)新的研究方向。糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[25]，可通過(guò)激活線粒體內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路中的Bcl-2家族中的凋亡前蛋白，啟動(dòng)凋亡程序，因此GSK-3β也被認(rèn)為是細(xì)胞程序性死亡的上游調(diào)節(jié)因子[26-27]。當(dāng)GSK-3β氨基端的Ser9磷酸化后可形成p-GSK-3β(磷酸化的糖原合成酶激酶-3β)，p-GSK-3β的含量增高可抑制GSK-3β的活性，從而起到抑制凋亡的作用[28]。p-GSK-3β也可以通過(guò)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(MPTP)的開(kāi)放來(lái)避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生[29]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(GLUTs)是負(fù)責(zé)葡萄糖等物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其中GLUT1(葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1)主要分布在大腦的血腦屏障上，是負(fù)責(zé)將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)細(xì)胞外液中，為大腦神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行供能[30-31]。足夠的能量供應(yīng)對(duì)提高腦缺血組織的腦細(xì)胞活力，穩(wěn)定膜電位，減輕細(xì)胞代謝紊亂，延遲能量衰竭引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡起到重要的作用[32-33]。p-GSK-3β還可通過(guò)TSC/mTOR(結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白)信號(hào)通路促進(jìn)誘導(dǎo)GLUT1的轉(zhuǎn)錄，增加細(xì)胞的存活[34]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針干預(yù)可以明顯提高針刺組大鼠腦組織中p-GSK-3β及GLUT1蛋白的表達(dá)，與模型組相比具有顯著差異；TUNEL染色可見(jiàn)造模后3 d大鼠腦組織細(xì)胞凋亡達(dá)到高峰，但隨著時(shí)間的改變，在造模后7、14 d時(shí)大鼠腦組織的細(xì)胞凋亡數(shù)也逐漸減少，同時(shí)間點(diǎn)針刺組較模型組減少更顯著；且隨著觀察時(shí)間的改變，針刺組大鼠腦組織HE染色可見(jiàn)損傷病灶范圍逐漸縮小，腦組織水腫及組織疏松逐漸減輕，損傷部位逐漸得到修復(fù)，而模型組大鼠腦組織整體修復(fù)情況較差。基于上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，電針干預(yù)可能通過(guò)提高腦組織中p-GSK-3β及GLUT1蛋白的表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善大鼠腦組織損傷區(qū)域及周圍組織的病理?yè)p傷狀況，對(duì)TBI后的神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，減輕TBI后的神經(jīng)繼發(fā)性損害。