葛根對細菌性腹瀉模型小鼠淋巴細胞水平和胃腸傳輸功能的影響研究*

董 娟，徐 杰，王新國，郭紅梅

新疆醫科大學附屬中醫醫院脾胃病科(烏魯木齊 830000)

胃腸道感染是兒童高發疾病，其中細菌性腹瀉因占據重要位置。有研究顯示[1]，Th1、Th2、Th17 淋巴細胞為主要代表的是 CD4+T 淋巴細胞亞群在感染性疾病和免疫相關等疾病中發揮著重要作用，故假設某種干預措施如果可以調節Th1、Th2、Th17 淋巴細胞的表達，應該可以實現治療細菌性腹瀉的目標。中藥復方因服用不便影響了患者的治療依從性，因此單味中藥以其簡效便廉的優勢逐漸成為研究重點。葛根具有升陽止瀉的功效，可有效治療細菌性腹瀉[2]，但其作用機制目前尚不明了，基于此我們以細菌性模型鼠為觀察對象，利用葛根干預，以期探討其可能作用機制，具體如下。

材料與方法

1 材 料

1.1 動物：30只健康雄性昆明小鼠(購自廣州市賽柏諾生物科技有限公司，編號：2612015007771)，均飼養于新疆醫科大學實驗動物中心。體重20～25 g，平均(22±1.5)g，周齡6～7周，平均(6±0.5)周。飼養環境：溫度(24±1.5)℃，濕度(50±2)%。本研究方案經過倫理委員會審批(審批號283921)。

1.2 藥物：葛根粉(購自安徽四全藥業，批號2322)。提取過程如下：葛根經水提→70%醇沉→氨水溶解→氯仿萃取→沉淀→丙酮溶解、回收→濃縮液。將濃縮液溶解成30 mg/(kg·d)水溶性葛根備用。

1.3 試劑與儀器：致病性大腸桿菌(EPEC-E2348/69，購自國家普通微生物菌種保藏管理中心)，流式細胞儀(美國Thermo公司，型號：Attune NxT)，血細胞分析儀(武漢科爾達醫療科技有限公司，型號：URIT-2981)、胃動素試劑盒(研域上海化學試劑有限公司，批號：3423)、血管活性腸肽(研域上海化學試劑有限公司，批號：4233)。

2 研究方法

2.1 分組及造模方法：30只健康雄性昆明小鼠，隨機分為模型組、干預組及空白組，各10只。各組小鼠體重、周齡等一般情況方面差異無統計學意義(P>0.05)，可進行組間比較。依據參考文獻[3]對模型組及干預組小鼠進行細菌性腹瀉模型制備，具體如下：對模型組、干預組小鼠灌胃0.3 ml的3% 碳酸氫鈉溶液30 min后再灌入0.5 ml的濃度5 × 108cfu/ml致病性 EPEC 混懸液，隨后將小鼠回籠飼養，隨后觀察各組小鼠的排便情況。空白組小鼠接受等劑量0.9%Nacl灌胃后回籠飼養。小鼠出現黏液便、稀便視為造模成功。

2.2 干預方法：成模后對干預組小鼠進行30 mg/(kg·d)葛根水溶性生物堿藥液灌胃，1次/d，連續灌胃7 d；模型組和空白組小鼠接受等體積生理鹽水灌胃，連續灌胃7 d。

3 觀察指標

3.1 腹瀉次數：記錄小鼠7 d腹瀉的總次數、腹瀉平均次數。

3.2 血數量變化：干預7 d后各組隨機取3只小鼠，取尾靜脈血，置于血球血細胞分析儀中進行測定，記錄其中白細胞、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比的數值。

3.3 外周血中Th1、Th2、Th17表達水平檢測：取尾靜脈血，加入小鼠淋巴細胞分離液后充分分離出淋巴細胞，收集于流式管內，隨后加入10%胎牛血清的 RPMI 1640 培養基，孵育5 h后加入1 ml的固定/破膜工作液(1 ml Fixation/Permeabilization Concentrate加入3 ml Fixation/Permeabilization Diluent稀釋)，旋渦混勻；再避光孵育30 min，充分離心后摒棄上清液加入1 ml 10X Permeabilization Buffer，離心洗滌細胞，破膜15 min(室溫避光)，充分離心后摒棄上清液；加入100 μl 1X Permeabilization Buffer，再分別加入熒光素標記的CD4(CD4-FITC)、5 μl藻紅蛋白標記的(IFN-γ-PE、IL-4-APC、IL-17A-APC)，操作按試劑盒說明書進行，采用流式細胞儀檢測Th1、Th2、Th17細胞。

3.4 IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A、胃動素、血管活性腸肽的表達水平檢測：取尾靜脈血，離心取上清液，用ELISA試劑盒進行檢測，將0.1 ml緩沖液加至反應孔內，4 ℃下孵育過夜后摒棄反應液，再加入0.1 ml樣本，37 ℃下孵育60 min，后加入0.1 ml酶標抗體，37 ℃下孵育60 min，隨后再加入TMB、硫酸，充分反應后將反應孔板置于酶標檢測儀上測定IL-4、IFN-γ、IL-17、胃動素、血管活性腸肽的表達水平。

3.5 結腸傳輸時間：將直徑1 mm的玻璃球經小鼠肛門逆插入2 cm處，然后記錄玻璃球從肛門排出的時間作為結腸傳輸時間。

3.6 各組胃平滑肌層Obestatin及其受體GPR39 表達：干預7 d結束后每組隨機取3只小鼠，麻醉處死后冰上進行開腹，游離大小網膜，取約4 cm×3 cm胃體，充分清洗后將胃平滑肌層充分剝離，冰浴中剪碎組織后加入蛋白裂解液，充分反應后4 ℃ 10000 r/min，離心30 min，取上清液，測定蛋白濃度后制定標準蛋白曲線，隨后將樣本置于SDS-PAGE 凝膠電泳分離出靶蛋白，隨后將靶蛋白轉移至PVDF 膜，脫脂牛奶封閉后加入一抗抗體(1∶1000稀釋)，4 ℃下孵育24 h后用PBS洗滌條帶，加入AP 標記的二抗(鼠抗兔 1∶1000)，室溫下孵育1 h后再用PBST 洗脫3次，5 min/次，滴加ECL顯影液顯影攝片。

4 統計學方法 采用 SPSS 22.0 統計學軟件。組間比較采用方差分析;組內比較采用配對t檢驗。所有數據均用均數±標準差表示，P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 各組小鼠腹瀉次數比較 見表1。空白組小鼠未出現腹瀉現象，模型組及干預組小鼠在造模6 h內均出現黏液便/稀便。經過葛根干預后小鼠腹瀉次數明顯減少，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 各組小鼠腹瀉情況比較(次)

2 各組小鼠血細胞及淋巴細胞亞群表達比較 見表2。造模后小鼠Th1、Th2細胞百分比、白細胞數量、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比明顯下降，Th17細胞百分比升高，與空白組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，經過干預后上述指標較前改善，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠血細胞水平變化比較(%)

3 各組小鼠胃動素、血管活性腸肽、結腸傳輸時間表達比較 見表3、4。造模后IL-17A、胃動素、血管活性腸肽表達明顯升高，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平降低，結腸傳輸時間明顯縮短，與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，經過葛根干預后上述指標明顯改善，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 各組小鼠IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A水平變化比較(pg/ml)

表4 各組小鼠胃動素、血管活性腸肽水平變化比較

4 各組胃平滑肌層Obestatin 及其受體GPR39 表達 造模后小鼠胃平滑肌層Obestatin 及其受體GPR39 表達明顯下降，與空白組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，經過葛根干預后Obestatin、GPR39表達明顯升高，與模型組比較差異有統計學意義(圖1)。

圖1 各組胃平滑肌層Obestatin及GPR39變化

討 論

本研究小鼠在經過致病性大腸桿菌感染后均出現了黏液便、稀便的癥狀，這是由于細菌導致模型鼠腸道黏膜完整性及上皮細胞受破壞，細菌毒素侵入導致腸道局部體液分泌增多而導致，由此我們發現小鼠外周血細胞成分也出現了變化，炎癥細胞百分比明顯升高，由此揭示本研究小鼠成功模擬腸道細菌感染，模型制備成功。在本研究中我們發現Th1、Th2、Th17以及代表性因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A表達已出現了變化，且胃平滑肌層的Obestatin 及其受體GPR39，這意味著腸道黏膜免疫系統和全身的免疫系統均產生了應答。

有研究[4-6]指出細菌性腹瀉等變態反應性疾病發生時體內的IL-2可發揮促進、維持淋巴T細胞活化增殖的作用，IL-4是活化B淋巴細胞的重要因子，促其分泌IgE和 IgG1，并誘導 IgG 加速轉型成IgE，以自分泌的方式誘導Th2的同時抑制Th1增殖及其應答。IL-10是抑制性細胞因子，它的濃度高低直接關系IL-2、IFN-γ等促炎因子的表達水平，并對Th1的免疫應答亦產生抑制作用。此外，IL-10作為一類抗炎介質對腸道毒素引發的炎癥有一定的滅活效應，有研究人員[7]指出模型鼠在接受葡萄球菌腸毒素注射4 h內其外周血IL-10濃度明顯提高，認為機體在接受葡萄球菌腸毒素時應激性地誘發IL-10分泌，以保護腸道黏膜，且在抑制IL-10表達后模型鼠死亡率明顯上升，在使用IFN-γ 抗體后模型鼠的腸道感染癥狀明顯好轉，這進一步說明了IL-10確有明顯的抑制炎癥效應，其作為Th2代表性因子確實參與細菌性腹瀉的發生發展過程。本研究結果與國內外諸多文獻研究數據一致[8-10]，IL-2/IL-4/IFN-γ/IL-10水平的上調可發揮抑制炎癥擴散的作用，避免了炎性連鎖反應。IL-17A是Th17淋巴細胞的代表性印制，其作用中藥的促炎因子介導IL-6、IL-8 等炎癥因子的募集及趨化，同時還可活化中性粒細胞以加劇炎癥效應。IL-17A在感染急性期處于高水平可促使機體產生免疫應答反應，有研究[11]顯示在感染急性期中和IL-17A的表達可減輕模型鼠的炎癥反應。因此我們有理由相信上調Th1、Th2以及其代表因子IL-2/IL-4/IFN-γ/IL-10水平，抑制Th17淋巴百分比及其代表因子IL-17A的表達是有效治療細菌性腹瀉的關鍵。

Obestatin是機體重要的酰胺化腦腸肽物質，是 G 蛋白偶聯受體GPR39 的內源性配體，在腸道有大量表達[12-13]。Obestatin/GPR39 系統可通過調節腸道血流而發揮抑制腸道收縮的效應，與此同時，Obestatin/GPR39 系統還可抑制巨噬細胞的抗原體成活性，減少炎癥反應引發的免疫應答過程發動機率。研究中我們還檢測了胃動素、血管活性腸肽的表達，其中胃動素屬于興奮性腸道激素，其濃度上調可明顯促進胃運動和胃電活動；血管活性腸肽可促進胃腸蠕動，還可誘導IL-10的分泌。本研究結果顯示造模后小鼠胃動素、血管活性腸肽表達明顯升高，胃平滑肌層Obestatin 及其受體GPR39 表達明顯下降，這說明細菌性腹瀉小鼠腸道蠕動增強[14-16]，抑制胃動素、血管活性腸肽表達，上調Obestatin/GPR39表達可實現治療細菌性腹瀉的目的。

細菌性腹瀉屬于祖國醫學“泄瀉”范疇，多與外邪侵入、飲食不節等導致脾失健運、腸道失司等有關，脾胃及腸道是主要病位，脾虛濕盛是該病發生發展的主要病機。葛根在《神農本草經》是被列為主藥，有解肌退熱、生津透疹、升陽止瀉的作用，葛根素、大豆苷等異黃酮類化合物是葛根的主要成分，臨床不乏其可有效改善腹瀉癥狀的報道。在本研究中我們利用單味中藥干預細菌性腹瀉模型鼠，結果發現模型鼠的腹瀉次數明顯減少，縮短了結腸傳輸時間，并上調了Th1、Th2細胞百分比、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、胃平滑肌層Obestatin 及其受體GPR39水平，抑制白細胞數量、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、Th17細胞百分比、IL-17A的濃度，這說明葛根可明顯改善胃腸感染，其作用機制與介導機體免疫反應有關。