攻下清熱活血方對重癥急性胰腺炎大鼠血清相關炎性因子及腸黏膜屏障功能的影響研究*

馬明和,劉永萍,劉 萍,顧存玲

1.青海大學附屬醫院 (西寧810000);2.青海大學醫學院生化教研室(西寧 810000)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是臨床上較為常見的一種重癥急腹癥，約為所有急性胰腺炎患者的15%左右，死亡率則可高達30%。目前，SAP發病機制尚未完全明晰，后續可進展為呼吸衰竭、多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)以及膿毒癥等病癥[1]。SAP在發病初期往往會合并腸屏障功能障礙(Intestinal barrier dysfunction，IBFD)，從而使得腸黏膜通透性增大。隨著醫學界對SAP腸溶性感染以及細菌易位等的了解逐漸深入，IBFD已為人們所普遍關注。目前，臨床研究證實：當SAP發病時，炎性因子的過度釋放是導致IBFD的一個非常重要的原因[2-3]。其中，IBFD發病的重要原因為促炎細胞因子與抗炎細胞因子水平失衡[4]。對于引起SAP的IBFD，在既往文獻資料報道中，多集中于小腸絨毛。新近研究表明：TNF-α及IL-1β等炎性因子與SAP疾病的進展具有十分緊密的關聯性[5]。根據如上關于SAP發病相關機制的分析，可為臨床治療該病提供一定的依據。本研究采用牛磺膽酸鈉(濃度為3.5%)于胰膽管逆行注射構建SAP大鼠模型，對攻下清熱活血中藥對SAP大鼠的療效及其對大鼠血清相關炎性因子及腸黏膜屏障功能的影響，報告如下。

材料與方法

1 實驗動物 選擇90只SD大鼠，雌雄大鼠各為45只，體重220～280 g，平均(247.69±22.28)g，清潔級，由我院實驗動物中心所提供。

2 藥品及相關試劑 攻下清熱活血中藥主要組方包括：生大黃、茵陳、柴胡、郁金以及紅藤等組方構成，由本院中藥制劑室制作而成的流浸膏備用； 奧曲肽(國藥準字 H20100099)； TNF-α及IL-1β檢測用的酶聯免疫試劑盒均購自于美國RapidBio公司； 戊巴比妥鈉(國藥準字 H31021725)。

3 動物造模 將本組90只SD大鼠隨機分為正常對照組與造模組，雌雄各占50%，其中正常對照組大鼠10只，造模組大鼠80只。正常對照組大鼠自由飲水，且給予標準飼料進行飼養。造模組大鼠在造模之前12 h禁食，且自由飲水。采用質量濃度為50 mg/kg的戊巴比妥鈉于腹腔注射予以麻醉，于正中切口將腹腔切開，實施胰膽管穿刺之后，使用濃度為3.5%的牛磺膽酸鈉，以1 ml/kg的速度微泵恒壓條件下胰膽管逆行注射，然后關腹進行縫合處理。

4 分組及給藥 由預實驗的具體情況可以得知，造模組大鼠的死亡率要顯著高于兩治療組，因此在對實驗動物進行分組時，將造模組大鼠確定為40只，奧曲肽治療組大鼠20只，攻下清熱活血中藥治療組大鼠20只。待造模過程完成之后開始給藥，奧曲肽組于皮下注射16.0 μg/kg的奧曲肽；中藥組以8.33 g/kg的量灌胃。正常對照組與模型組均給予等劑量的生理鹽水進行灌胃，上述操作每次間隔為8 h，共3次。

5 標準采集與分析 ①標本采集。大鼠造模完成之后的24 h將大鼠處死，取大鼠血清備用；取胰腺組織及小腸組織，使用濃度為4%的多聚甲醛加以固定，采用酒精進行逐級脫水，石蠟切片。②采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA法)對大鼠血清中TNF-α及IL-1β水平進行測定分析。③表征腸黏膜屏障功能的黏蛋白(Mucin，MUC2)采用免疫組化法進行測定分析。于光學顯微鏡下予以觀察，每張切片選擇5個視野，每個視野選擇100個細胞進行觀察。陽性表達判定方法：由于MUC2位于細胞漿，凡是觀察到棕黃色或者黃色的顆粒則可判定為陽性細胞，根據陽性細胞所占比例以及陽性細胞強度進行評分。具體評分標準為：①0分：陽性細胞比例在5%以內；②1分：陽性細胞比例為(5%～30%)；③2分：陽性細胞比例為(30%～60%)；④3分：陽性細胞比例在60%以上。陽性細胞染色強度評分標準為：①0分：細胞質內無染色；②1分：細胞質內染色為淡黃色；③2分：細胞質內染色為黃色；④3分：細胞質內染色為棕黃色。陽性細胞比例與陽性細胞染色強度評分乘積即表示為免疫組化染色評分[6]。

結 果

1 各組大鼠24 h存活情況比較 奧曲肽組大鼠24 h存活率為40.00%(8/20)，中藥組大鼠24 h存活率為45.00%(9/20)，模型組存活率為25.00%(10/40)。兩治療組大鼠存活率均高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)，奧曲肽組與中藥組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2 各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平比較 見表1。模型組、奧曲肽組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平均分別高于正常對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，奧曲肽組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平與模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，中藥組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平分別顯著低于模型組、奧曲肽組，差異具有統計學意義(P<0.05)，但中藥組與正常對照組大鼠血清大鼠血清TNF-α及IL-1β水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平比較(μg/ml)

3 各組大鼠MUC2免疫組化評分比較 見表2。采用免疫組化法對各組大鼠MUC2表達情況進行觀察，結果表明，正常對照組MUC2陽性細胞表達率較高，主要為棕黃色或者黃色；模型組與正常對照組相比，MUC2陽性細胞表達率較低，染色程度相對較低，免疫組化評分低于正常對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)；奧曲肽組MUC2陽性細胞表達率顯著高于模型組，中藥組MUC2陽性細胞表達率高于奧曲肽組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠MUC2免疫組化評分比較(分)

討 論

祖國醫學認為，SAP屬“結胸”“腹痛”等范疇。該病發病特征為飲食不節、酗酒、暴飲暴食或者七情內傷，對肝膽脾胃產生損傷，導致肝氣邪結，脾胃運化失職，內生痰濁，濁邪蘊積化熱，引起邪熱蘊積，對臟腑產生損傷作用，從而使得腑氣不暢，氣滯血瘀。按照該病的病因以及具體的臨床特征，其病機主要為邪熱、腑實以及血瘀等。因此，本研究觀察組將攻下清熱活血中藥用于治療SAP中，其可對胰腺組織病理加以改善，使得血清淀粉酶濃度顯著下降，對SAP大鼠具有十分理想的治療效果。

SAP之所以保持較高病死率，主要是由于其常合并全身炎癥反應綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及MODS或多器官功能衰竭等癥。而SAP及其誘發的SIRS、MODS及多器官功能衰竭發病與TNF-α、IL-1β等炎性因子相關。上述炎性因子主要源自于內毒素刺激的單核-巨噬細胞，是炎癥急性反應早期的常見炎性因子，由于其具有促炎作用，因此常被稱為“促炎因子”。二者可以促使內皮細胞對白細胞的黏附作用，對內皮細胞產生刺激性作用，從而分泌產生炎性介質，對凝血系統產生激活作用，抑制纖溶以及促使炎性滲出等，從而加快單核-巨噬細胞釋放出大量的TNF、IL-1、IL-8等因子[7]。目前臨床研究表明[8-10]，TNF-α屬于一種炎性反應的啟動介質，可介導胰腺局部以及全身出現炎性反應；而IL-1β雖然并非為SAP啟動的必須因子，然而可能為炎癥開始之后加劇以及播散炎癥的重要角色。在SAP發病初期，胰腺之中的炎性細胞與胰腺泡細胞就會釋放出大量的TNF-α、IL-1β等炎性因子[11-13]。本研究結果顯示：模型組、奧曲肽組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平均分別顯著高于正常對照組，奧曲肽組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平均分別顯著小于模型組，中藥組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平均分別低于模型組、奧曲肽組，但中藥組與正常對照組大鼠血清大鼠血清TNF-α及IL-1β水平比較，差異無統計學意義。上述結果提示，攻下清熱活血中藥對SAP的治療作用主要是通過促使SAP大鼠血清TNF-α及IL-1β水平來實現的，而中藥如何對SAP細胞因子網絡多靶點及多環節進行調控，尚需更深入地研究。

腸黏液層是有效防御腸道細菌與有害物質侵入的一個重要屏障，其主要成分為黏蛋白。MUC2是構成腸黏液中最為重要的黏蛋白，其數量與結構的變化同腸黏膜屏障受損存在十分緊密的關聯性[14-16]。本研究結果顯示：正常對照組MUC2陽性細胞表達率較高，主要為棕黃色或者黃色；模型組與正常對照組相比，MUC2陽性細胞表達率較低，染色程度相對較低，免疫組化評分顯著低于正常對照組；奧曲肽組MUC2陽性細胞表達率顯著高于模型組，中藥組MUC2陽性細胞表達率顯著高于奧曲肽組。此結果提示，當SAP發病時，會對腸上皮細胞產生破壞作用，導致MUC2分泌量顯著下降，腸黏膜層由于來源不確切而削弱腸屏障功能；攻下清熱活血中藥能夠有效保護腸上皮細胞，使其免遭損傷，使得MUC2分泌量顯著升高，修復了腸黏膜層，對腸黏膜機械屏障的完整性具有很好地保護作用，維持了腸道的正常生理狀態。

綜上所述，攻下清熱活血中藥可對SAP大鼠具有理想的治療作用，可通過降低血清TNF-α及IL-1β水平來實現，此外其還對SAP大鼠腸黏膜具有保護效果，加快腸黏膜屏障功能恢復。