南方紅豆杉不同部位紫杉烷類含量累積規律分析*

葉 冰,華成坤，梁淑妍，王穎芳

1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院藥學部 (廣州 510405 );2.廣東藥科大學中藥學院 (廣州 510405)

南方紅豆杉Taxus mairei[(Lemee et Levl)S.Y.Hu ex Liu]又稱美麗紅豆杉，是紅豆杉屬中生長速度最快的品種，為中國特有[1-2]，紫杉醇(Taxol)作為南方紅豆杉中一種次生代謝產物，是目前公認的廣譜、活性強的抗癌藥物之一[3]。然而，紫杉醇天然資源十分有限，主要存在于紅豆杉科植物樹皮及嫩枝中且含量極低，尋找及擴大紫杉醇藥源成為醫藥領域研究人員關注的重點[4-5]。近年來對于紅豆杉中抗癌有效物質的研究發現，紅豆杉植物中存在大量的具有三環二萜的基本骨架化合物——紫杉烷類物質，并在其中一些發現具有抗腫瘤活性[6]且與紫杉醇存在一定的化學相關性成分，可通過直接生物合成或者間接的結構轉化形成紫杉醇[7-8]。

經早期研究及相關文獻顯示[9]，8～9月為南方紅豆杉紫衫烷類物質的最佳采收季節，但對于此時其不同部位的紫衫烷類含量分布情況缺乏有效考察。本文由此出發，對南方紅豆杉中不同部位紫杉烷類物質分布及其含量積累的規律進行分析。

材料與方法

1 藥 材 南方紅豆杉樣品采自于遵義市播州區景森紅豆杉種植場10年生植物，經藥學系專人鑒定為紅豆杉科紅豆杉屬南方紅豆杉，8月初于種植場隨機選取10株紅豆杉，分別采集其主干樹皮、側枝樹皮(側皮)、根皮、須根、莖(嫩枝)、葉等6個組織器官。將藥材陰干，粉碎，粉末過60目篩，備用。

2 儀器與試藥 紫杉醇(批號：180381-181124)，三尖杉寧堿(批號：180926-201802)，7-表-10-去乙酰基紫杉醇(批號：180925-181022)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(批號：BW6337)購自北京北研綠生物技術有限公司；色譜甲醇(批號：382993)購自天津市四友精細化學品有限公司；正己烷(批號：20180314)購自上海凌峰化學試劑有限公司；二氯甲烷(批號：20180503)購自天津永大化學試劑有限公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

AB135-S電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；AR224CN電子分析天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；RE-52AA旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；Dionex UltiMate3000型液相色譜儀[Dionex(中國)有限公司]；色譜柱inertsil ODS-SP(250×4.6 mm,5 μm，日本島津)。

3 研究方法

3.1 色譜條件：色譜條件為：HPLC儀為日本島津SPD-20A全自動高效液相色譜儀,色譜柱為inertsil ODS-SP(250×4.6 mm，5 μm)柱，柱溫：30 ℃，流動相為甲醇∶水(0～16 min，44%；16～20 min，44%～62%；20～25 min，62～67%；25～30 min，67%～70%；30～35 min，62%～70%；35～40 min，62%)，檢測波長:227 nm,流速：0.5 ml/min,進樣量：5 μl。

3.2 對照品溶液的制備：分別精密稱取10-DABⅢ、三尖杉寧堿、紫杉醇、7-表-10-去乙酰基紫杉醇標準品適量，用甲醇定容到每1 ml分別含0.0427 mg、0.0248 mg、0.0324 mg、0.0284 mg的混合對照品溶液，備用。

3.3 供試品溶液的制備：精密稱取制備好干燥的南方紅豆杉樣品，每份1.0 g，置50 ml磨口具塞三角瓶中，分別加入甲醇25 ml，浸潤30 min后，超聲提取30 min，超聲頻率為32 kHz，提取2次，抽濾，合并濾液，于30 ℃減壓蒸干，浸膏用45 ml甲醇溶解后加入5 ml蒸餾水，搖勻后，用50 ml正己烷萃取，振蕩多次后，靜置30 min，脫脂，重復多次至正己烷無色，棄去正己烷層；甲醇相用30 ℃減壓蒸干，浸膏用50 ml二氯甲烷溶解后加入等體積蒸餾水萃取，超聲數秒，分相后，二氯甲烷層再用水萃取兩次，將二氯甲烷相真空濃縮至干，用5 ml甲醇溶解、定容，用0.45 μm過濾后，HPLC檢測。

3.4 標準曲線繪制：采用25 ml容量瓶分別吸取1、5、10、15、20 ml混合對照品儲備液，用甲醇稀釋至刻度，按色譜條件，分別精密吸取10 μl進樣，以峰面積積分值為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，所得結果如下，該相關系數和線性范圍均符合測定要求。見表1。

表1 四種紫杉烷類成分線性關系

3.5 精密度試驗： 按“色譜條件”項目下檢測條件，精密吸取供試品10 μl，連續進樣6次，結果顯示儀器精密度良好。見表2。

3.6 重復性試驗： 稱取6 份同批次紅豆杉樣品，按“供試品溶液的制備”項目下制備方法制備供試品，進樣10 μl，測定其峰面積，計算各成分質量分數及RSD,結果表明實驗方法可靠。見表2。

3.7 穩定性試驗： 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測得峰面積值，結果表明供試品溶液在24 h內穩定。見表2。

3.8 加樣回收率試驗： 取同一批紅豆杉樣品 6 份，每份1.0 g，分別精密加入混合對照品溶液1.00 ml，按前述方法制備樣品液，測定其含量，并計算加樣回收率，結果表明4種成分回收率符合要求，測定方法準確。見表2。

表2 四種紫衫烷類成分方法學考察(%)

結 果

分別取南方紅豆杉不同部位藥材等分，精密稱定，按照“供試品溶液的制備”項目下制備方法制備供試品，并按照前述色譜條件進行進行HPLC檢測分析，測定其峰面積后取平均值，其中峰面積代表紫杉烷類成分含量。見表3。

表3 南方紅豆杉不同部位四種紫杉烷類的峰面積(n=10)

對南方紅豆杉的主干樹皮、側枝樹皮、根皮、須根、嫩枝、葉等六個組織及器官對四個紫杉烷類含量進行分析可知：①10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ在不同組織器官含量相差較大。具體含量分布順序為：葉>莖>主根皮>須根>側皮>主干樹皮。②三尖杉寧堿在不同組織器官含量分布存在比較明顯的差異，含量分布順序為：主根皮>須根>葉>主干樹皮>莖>側皮。③紫杉醇在不同組織器官含量分布存在比較明顯的差異，含量分布順序為：主根皮>須根>主干樹皮>葉>莖>側皮。④7-表-10-去乙酰基紫杉醇在不同組織器官含量分布存在比較明顯的差異，含量分布順序為：側皮>須根>主根皮>主干樹皮>莖>葉。

討 論

近年來,尋找及擴大紫杉醇藥源是一個十分活躍的研究領域，并取得了較大的進展，目前生產紫杉醇的方法主要有植物提取法[10]、紅豆杉細胞工程法[11]、化學半合成或全合成法[12]、基因工程法和內寄生真菌生產法[13-14]等，但是由于現今的技術水平的缺陷，人工栽培這種方法對緩解紫杉醇資源問題似乎更加具有可操作性，是近幾年紫杉醇和重要紫杉烷的重要來源[15]。

經文獻[9]及本文早期研究發現南方紅豆杉紫衫烷類最佳采收季節為8～9月，而植物在不同季節其不同部位組分有較大差異，故而有必要重新進行考察。本文利用HPLC法測定10年生南方紅豆杉植株8月的主干樹皮、側皮、根皮、須根、莖、葉等六個組織器官中四種紫杉烷類成分含量。結果由表3可知，10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ在葉、莖中含量比較大，在樹皮、根中含量少；三尖杉寧堿在根中含量最高，而在側皮中幾乎沒有；紫杉醇在根部及主干樹皮中含量較高，7-表-10-去乙酰基紫杉醇則在側皮中最高，在葉中基本沒有。提示紫杉烷類物質在植株不同組織器官的可能分布規律：葉是合成紫杉醇前體物質的主要器官，而皮與根則是合成及積累紫杉醇的主要組織器官。預測紫杉烷類在體內轉移的方式：以水溶性紫杉烷類前體物質轉移，以紫杉醇的形式在體內特定部位如韌皮或次生木質部儲存，同類組織器官紫杉烷類之間存在相互轉化關系。需要指出的是影響紅豆杉植株中紫杉烷類物質積累的因素是十分復雜的,不同區域、不同年限等因素均能對其成分產生影響，后續還需進一步分析，以確定其關鍵影響因素，為南方紅豆杉的開采及利用提供依據。