抗纖益心方對擴張型心肌病大鼠Smad3 及其相關miRNAs 的影響

楊 曦，熊 劍，魏云杰

（湖北省十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬醫院心血管內科，湖北 十堰 442000）

擴張型心肌病（DCM）指以心室心腔擴大和收縮功能障礙為特征的復合型心肌病，會引起心力衰竭（簡稱心衰）、心律失常和猝死［1］。該病的發病群體以50 歲以上中年人居多，起病緩慢，早期診出率較低［1］，且病因不明，致死率較高，無特效治療手段，預后極差［2］。中醫根據DCM 的癥狀及病理特點，將其歸于“心衰病”“水腫”“心水”等范疇，病機在于心之陽氣不足，無力推動血行，瘀血積聚，或水飲不化，痰濕停留，繼而使心體脹大［3］，因此益氣、活血、利水為治療該病的基本原則。西醫常規治療以對癥治療、控制心律失常和心衰、糾正心室重構為主，但其遠期療效有限；中醫可明顯緩解其臨床癥狀，毒副作用較西藥少，在改善心肌異常、逆轉心肌纖維化，降低病死率，提高生活質量，改善預后方面均有明顯優勢［3-4］。抗纖益心方具有益氣升陷、活血化瘀功效，能改善臨床癥狀，減小左室舒張末內徑、左房內徑，改善心功能［5-6］。王振濤等［7］的研究結果顯示，抗纖益心方可下調DCM 模型大鼠基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）和上調基質金屬蛋白酶-1 抑制劑（TIMP-1）蛋白水平，減輕心肌組織纖維化，抑制心室重構。張會超等［8］也觀察到抗纖益心方對DCM 大鼠心肌纖維化有一定的抑制作用，并能改善心功能，其作用機制與轉化生長因子β（TGF-β）/Smads 信號系統密切相關。微小RNA（miRNAs 或miRs）是一系列長約22 nt 的非編碼RNA，能通過海綿作用吸附其靶向mRNA，調控了有機體超過70%的基因活動，是近幾年病理機制研究的熱點，為諸多疾病的臨床診治提供了新靶點和新方向。心肌纖維化增生導致的心室重構是擴張型心肌病發生與發展的中心環節［9］。本研究中選取Smad3，對可能調控其mRNA表達的miR-23-3p 和miR-145-5p 進行了分析，觀察了抗纖益心方對各指標的影響，以及各指標間的關系，探討抗纖益心方治療DCM 的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：ABI 7500 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）擴增儀（美國應用生物系統公司）；Nanodrop 分光光度計（天根生化科技＜北京＞有限公司）；Mini-PROTEAN? Tetra 小垂直板電泳槽（伯樂生命醫學產品＜上海＞有限公司）；Trans-Blot 小型轉印槽（伯樂生命醫學產品＜上海＞有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 圖像處理分析系統（美國Media Cybemetics 公司）；1-14k型臺式高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；Vevo 770TM型小動物彩色多普勒超聲儀［加拿大VisualSonics Inc.公司，電壓為（220±22）V，頻率為（50±1）Hz，主機采集頻率≥1 000 Hz，大鼠實驗探頭頻率為15～22 MHz］。

試藥：抗纖益心方為干浸膏，由黨參、黃芪、云苓、白術、丹參、川芎、紅花、赤芍、澤蘭和益母草組方，由醫院制劑室提供，每1 g 浸膏相當于生藥4 g；呋喃唑酮片（山西云鵬制藥有限公司，批號為I-14023937）；卡托普利片（常州制藥廠有限公司，批號為I-B2023731）；戊巴比妥鈉（中國醫藥＜集團＞上海化學試劑公司，批號為F20021216）；Smad3 多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的二抗（中國Abcam 官網，批號分別為GR160516-2，GR160311-1）；miR-23-3p、miR-145-5p 擴增引物（生工生物工程＜上海＞股份有限公司，批號分別為20160211，20160218）；實時熒光定量PCR 試劑盒（上海羅氏公司，批號為75117）；TGF-β、MMP-1 及TIMP-1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（生工生物工程＜上海＞股份有限公司，批號分別為D730443，D730566，D730582）。

動物：健康清潔級Wistar 大鼠90 只，雌雄各半，6～8 月齡，體質量（220±20）g，購自山東魯抗動物中心［合格證號為SCXK（魯）2016-0003］。所有大鼠常規飼養，自由進食進水，溫度22～25 ℃，相對濕度40%～60%。本研究經湖北醫藥學院動物倫理委員會審批，動物飼養、干預及處死等操作均遵循有關實驗動物管理和使用規定。

1.2 試驗方法

動物分組與模型制備：所有大鼠適應性飼養1 周后稱定體質量，根據體質量進行隨機區組化分組，分為對照組（A 組）、模型組（B 組）、卡托普利組（C 組）、抗纖益心方低劑量組（D 組）、抗纖益心方中劑量組（E 組）和抗纖益心方高劑量組（F 組），各15 只。A 組正常飼養；其余5 組均參照文獻［10］的方法制備DCM 大鼠模型，將存活大鼠行超聲心動圖檢查，與A 組大鼠比較，左心室腔擴大，室壁變薄，左心室射血分數低于40%為造模成功［7］。造模成功后予以藥物干預，根據LD50實驗［11］確定動物的有效給藥劑量，以此設置抗纖益心方高、中、低3個劑量。C 組大鼠每日灌胃卡托普利10.125 mg/kg；D組、E 組、F 組大鼠每日分別灌胃抗纖益心方4.7，9.4，18.8 mg/kg；A 組與B 組大鼠予等量無菌蒸餾水灌胃刺激。共灌胃8 周，給藥期間，B 組有2 只大鼠死亡，D 組有1 只死亡，其余大鼠均進行后續實驗，并納入最終的試驗結果中，最終A 組、B 組、C 組、D 組、E 組和F 組的大鼠樣本量分別為15，13，15，14，15，15 只。

超聲心動圖測定心功能：各組大鼠最后1 次給藥24 h 后，給予50 mg/kg 1%戊巴比妥鈉麻醉，采用超聲心動圖檢測大鼠心功能指標：左室收縮末壓（LVESP）、左室舒張末壓（LVEDP）及左心室內壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）。

蛋白質印跡（WB）法檢測心肌Smad3 蛋白表達：將大鼠麻醉后，先開腹，取腹腔主動脈血2 mL，用于熒光定量PCR 試驗，再開胸腔取心臟，吸干水分，并稱定質量。從心尖位置沿冠狀面切取心肌組織2 份，-80 ℃存儲。取待測心肌100 mg，置2 mL 離心管中，剪碎，加入400 μL 裂解液（RIPA ∶PMSF=100 ∶1），電動勻漿器勻漿，充分裂解后離心，12 000 r/min 離心5 min，將上清液轉移至新的EP 管中，-20 ℃存儲，當天使用。首先，采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，應用buffer 緩沖液配置質量濃度為1.0 μg/μL 的混懸液，以備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用5 %濃縮膠和10 %分離膠進行蛋白電泳；上樣前先將蛋白質樣本煮沸10 min 使其變性，上樣時調整上樣量，保證一致；先80 V 電泳30 min，再120 V 至電泳完成；80 V 恒壓轉膜1 h；室溫條件用5%脫脂奶粉封閉2 h；加入用Tween-20 Tris 鹽酸稀釋的Smad3 多克隆抗體（1 ∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 液清洗3 次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1 ∶1 000）室溫孵育2 h，TBST 液清洗3 次，每次10 min；ECL 顯色液A 液和B 液混合均勻1 min 后，將膜蛋白面與ECL 底物充分接觸1 min，放入X 光片夾中；置暗室中曝光、顯影、定影。顯影后掃描蛋白質印跡顯影圖，用ImageJ圖像分析軟件分析條帶灰度值，以目標蛋白質條帶灰度值與內參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值（Smad3/β-actin）代表目標蛋白質的相對表達量。

雙熒光素酶試驗測定Smad3 和miRNAs 間的靶向性：試驗細胞為大鼠心肌成纖維細胞，培養至對數生長期，接種至96 孔板，設為pmir-GLO 組、Smad3-WT組、Smad3-MUT 組，每組6 個復孔。分別將pmir-GLO質粒、Smad3-WT 質粒和Smad3-MUT 質粒轉染至相應的細胞，培養6 h，更換培養基再培養48 h。將轉染后的細胞進一步分為2 個亞組，分別采用miRNA mimics（miR-145-5p，miR-129-3p，miR-23-3p）及其對照NC mimics 干預，加入相應miRNA mimics 和NC mimics，更換培養基培養24 h 后行雙熒光素酶報告基因實驗。按雙熒光素酶報告試劑盒說明書要求裂解細胞，配置發光液，先將20 μL 樣品置入測量管，再加入100 μL發光液，輕輕敲擊管壁，使其混勻。記錄螢火蟲熒光素酶的相對熒光活性。

實時熒光定量PCR 法檢測miR-23-3p 及miR-145-5p 的表達水平：采用Trizol 法提取全血總RNA，用nanodrop 分光光度計檢測RNA 的純度和濃度，質量合格的樣本置-80 ℃保存，用于后續試驗。采用Prime-ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 進行RNA 反轉錄，嚴格按試劑盒步驟操作。反轉錄完成后置-80 ℃保存備用。采用GoTaq? qPCR Master Mix 試劑盒和ABI 7500 型實時熒光定量PCR 擴增儀檢測miR-23-3p和miR-145-5p 的表達水平。反應體系：GoTaq? qPCR Master Mix 25 μL，upstream primer 1.0 μL，downstream primer 1.0 μL，模板cDNA 1.0 μL。反應條件：95 ℃1 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共擴增40 個循環；溶解曲線95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃1 s。每個樣本做3 個重復，最終的Ct 值取3 個重復的平均值。選擇U6 作為內參基因，miR-23-3p 和miR-145-5p 的相對表達量以公式n=2-ΔΔCt來計算。

ELISA 法檢測TGF-β、MMP-1 及TIMP-1 蛋白水平：取適量心肌組織，剪碎，勻漿，嚴格按TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 ELISA 試劑盒的操作說明檢測心肌組織研漿液的TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 蛋白水平。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計學軟件分析。數據均為連續性變量，采用± s 表示，多組間比較采用單因素方差分析；如有統計學差異則采用LSD- t 檢驗。

2 結果

2.1 大鼠心功能指標

與A 組相比，B 組大鼠的LVESP 和±dP/dtmax明顯下降，LVEDP 明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.05）。與B 組相比，C 組、D 組、E 組、F 組大鼠的LVESP 和±dP/dtmax顯著升高，LVEDP 顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。與D 組相比，E 組和F 組大鼠的LVESP和±dP/dtmax顯著升高，LVEDP 顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較（ ± s）

表1 各組大鼠心功能指標比較（ ± s）

注：與A 組相比，*P ＜0.05；與B 組相比，△P ＜0.05；與D 組相比，#P ＜0.05。

組別A 組（n=15）B 組（n=13）C 組（n=15）D 組（n=14）E 組（n=15）F 組（n=15）LVESP 135.2±11.3 75.9±10.1*116.9±10.4△97.4±9.6△129.2±9.3△#130.8±8.9△#LVEDP 5.6±1.3 10.9±1.8*6.5±1.4△8.3±1.9△5.2±1.7△#5.4±1.5△#+dp/dtmax 3 897±699 3 021±330*3 469±219△3 199±411△3 701±503△#3 821±415△#-dp/dtmax 3 753±272 3 029±243*3 489±236△3 099±254△3 600±259△#3 697±356△#

2.2 對DCM 大鼠Smad3 表達水平的影響

與A 組相比，B 組大鼠的心肌Smad3 蛋白表達明顯升高；與B 組相比，C 組、D 組、E 組、F 組大鼠的心肌Smad3 蛋白表達水平顯著降低；與D 組相比，E 組和F 組大鼠的心肌Smad3 蛋白表達水平降低，且F 組低于E 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1。

圖1 各組擴張型心肌病大鼠Smad3 表達水平

2.3 Smad3 相關miRNAs 的驗證

生物信息學分析結果顯示，在與Smad3 基因存在結合位點的鼠源miRNAs 中，miR-145-5p，miR-129-3p，miR-23-3p 有較高的研究價值。采用雙熒光素酶報告試驗檢測了以上3 種miRNAs 與Smad3的結合能力。結果見圖2。可見，miR-145-5p 與Smad3，miR-129-3p 與Smad3 均有較高的靶向結合能力。

圖2 Smad3 基因相關的miRNAs 生物信息學及雙熒光素酶分析結果

2.4 對DCM 大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表達水平的影響

與A 組相比，B 組大鼠的循環miR-23-3p 和miR-145-5p 表達水平明顯降低（P＜0.05）；與B 組相比，C 組、D 組、E 組、F 組大鼠的循環miR-23-3p和miR-145-5p 表達水平明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與D 組相比，E 組和F 組大鼠的循環miR-23-3p 和miR-145-5p 表達升高，且F 組高于E 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 6 組擴張型心肌病大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表達水平比較（ ± s）

表2 6 組擴張型心肌病大鼠miR-23-3p 和miR-145-5p表達水平比較（ ± s）

注：與A 組相比，*P ＜0.05；與B 組相比，△P ＜0.05；與D組相比，#P ＜0.05；與E 組比較，□P ＜0.05。下表同。

組別A 組（n=15）B 組（n=13）C 組（n=15）D 組（n=14）E 組（n=15）F 組（n=15）miR-23-3p 4.235 ±0.161 2.789 ±0.187*4.089 ±0.192△3.358 ±0.137△4.007 ±0.155△#4.169 ±0.163△#□miR-145-5p 4.282 ±0.104 2.309 ±0.175*4.197 ±0.140△3.324 ±0.131△4.173 ±0.128△#4.201 ±0.143△#□

2.5 心肌組織Smad3 表達與循環miR-23-3p 和miR-145-5p 水平的相關性

Pearson 檢驗結果顯示，大鼠心肌組織Smad3 表達與循環miR-145-5p 水平呈負相關性（R=-0.848，P＜0.05）；與循環miR-23-3p 水平也呈負相關性（R=-0.813，P＜0.05），其相關直線見圖3。

圖3 心肌組織Smad3 表達與循環miR-145-5p，miR-23-3p水平的相關直線

2.6 對DCM 大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平的影響

與A 組相比，B 組大鼠的TGF-β 和MMP-1 表達水平明顯升高（P＜0.05），TIMP-1 的表達水平明顯降低；與B 組相比，C 組、E 組、E 組、F 組大鼠的TGF-β和MMP-1 表達水平明顯降低，TIMP-1 表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與D 組相比，E 組和F 組大鼠的TGF-β 和MMP-1 水平降低，且F 組低于E 組；E 組和F 組大鼠的TIMP-1 水平升高，且F 組高于E 組，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

表3 6 組擴張型心肌病大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平比較（ ± s）

表3 6 組擴張型心肌病大鼠TGF-β，MMP-1 及TIMP-1 水平比較（ ± s）

組別A 組（n=15）B 組（n=13）C 組（n=15）D 組（n=14）E 組（n=15）F 組（n=15）TGF-β（μg/g）46.2±3.7 68.3±7.9*49.2±5.4△59.5±6.5△52.3±5.8△#47.2±5.2△#□MMP-1（ng/g）244.2±32.1 455.2±41.3*293.8±35.1△370.2±40.4△300.1±27.4△#275.6±21.7△#□TIMP-1（ng/g）696.2±75.2 463.7±55.5*655.3±58.3△477.8±51.9△544.7±60.8△#602.8±60.6△#□

3 討論

中醫認為，DCM 多因先天不足，或因后天失養，導致心氣虛，調治不當，發展為心陽虛、心之氣陰兩虛，形成瘀血、痰濕、水飲等病理產物，病位在心，與肺、肝、脾、腎密切相關［3，12］。王曉景等［13］的研究結果顯示，DCM 為本虛標實、虛實夾雜之癥，本虛以陽虛、氣虛為主，標實以血瘀、水停為主。DCM 心氣虛是基礎，心氣虧虛，鼓動無力，血脈不暢必致血瘀，血瘀是中心環節，氣虛血瘀存在于病變發展過程中的各個環節，故采用抗纖益心方治療該病療效可靠［5-8］。

心室重構是擴張型心肌病發生與發展的中心環節，心肌組織纖維化增生是參與心室重構的關鍵［14］。抗纖益心方對改善DCM 的臨床癥狀和心室形態有積極作用，但其藥理機制尚不明確。TGF-β1信號是參與纖維化增生的主要信號之一，在各種原因導致的心室重構中均介導重要機制［15］。Smads 家族蛋白是將TGF-β1信號從胞膜和胞質傳遞至胞核的重要轉運蛋白，TGF-β 的直接作用底物，為TGF-β 信號通路中的關鍵傳導分子［16］。目前，已知的Smads 家族蛋白主要為Smad1～Smad9，其中參與TGF-β1信號轉導的主要為Smad2 和Smad3，由于Smad3 是介導心肌纖維化增生和心室重構的關鍵物質，故選擇Smad3［17］。TGF-β1/Smad3 信號通路在多種原因導致的心室重構中起介導作用，體外細胞學試驗證實，其作用機制可能與誘導纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，增強膠原蛋白的分泌等有關［18］。機體在正常狀態下，對心室重構起決定作用的心肌細胞外基質處于產生和降解的動態平衡，MMPs 是體內參與心肌細胞外基質降解的最主要酶系，TIMP-1 是MMP-1 的特異性抑制劑，故兩者間的平衡對維持心臟正常的代謝具有重要意義［19］。TGF-β 是一種心肌細胞外基質的有效調節因子，能促進膠原的合成，并調節多種編碼MMP 的基因表達。研究顯示，抗纖益心方能抑制DCM 大鼠TGF-β1的表達，這可能是抗纖益心方干預DCM 大鼠動物模型心室重構的機制之一［8，20］。本研究結果顯示，抗纖益心方DCM 大鼠心肌組織中Smad3 的表達有抑制作用，也就抑制了TGF-β / Smad3 信號通路的激活，減輕心肌組織的纖維化，因此對于改善其心肌功能有明顯效果。

本研究中在分析Smad3 與miRNAs 相關性前，首先采用生物信息學分析和雙熒光素酶試驗驗證了Smad3與各個miRNAs 的結合能力，從中篩選了miR-23-3p和miR-145-5p 這2 項指標。SUN 等［21］的研究已證實，miRNAs 主要通過與靶向mRNA 的非編碼區、開放閱讀框、啟動子或RNA 結合蛋白結合，從而導致靶向mRNA 降解或翻譯抑制。有研究顯示，miR-23-3p 和miR-145-5p 對Smad3 的表達有負調控作用，當miR-23-3p 和miR-145-5p 的表達水平較高時，Smad3 的表達水平降低［22］。本研究結果顯示，DCM 大鼠的Smad3 表達水平升高，miR-23-3p 和miR-145-5p表達水平降低，其變化趨勢相反，Pearson 檢驗也證實Smad3 和miR-23-3p、Smad3 和miR-145-5p 間呈負相關，從臨床角度證實了在DCM 中各個指標存在相互作用。ELISA 結果顯示，抗纖益心方能明顯改善DCM大鼠的TGF-β，MMP-1，TIMP-1 蛋白表達水平，尤其是高劑量抗纖益心方基本與西藥卡托普利的藥效相當。本研究結果顯示，應用抗纖益心方后，大鼠的循環miR-23-3p，miR-145-5p，TIMP-1 水平升高，心肌組織Smad3 和TGF-β，MMP-1 表達水平降低；另外，各指標的變化趨勢受抗纖益心方劑量的影響，呈劑量依賴性，其最佳劑量尚有待驗證。

綜上所述，抗纖益心方可上調DCM 大鼠的miR-23-3p 和miR-145-5p 的表達，下調Smad3 的表達，進而影響TGF-β/Smad3 通路，從而改善DCM 大鼠的心功能，其最佳有效劑量和用藥時間還有待進一步研究。