肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞X 染色體耦聯(lián)鋅指蛋白的表達(dá)及復(fù)方苦參注射液的調(diào)控作用

宋昌興，李 新，馬春蘭，張常虹，安貴忠

（1. 青海省第五人民醫(yī)院，青海 西寧 810007； 2. 青海省政務(wù)服務(wù)監(jiān)督管理局，青海 西寧 810007）

肝內(nèi)膽管癌（ICC）是原發(fā)性肝癌中的第二高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞肝癌的肝臟原發(fā)惡性腫瘤，在東南亞地區(qū)較常見［1-2］。其確切病因尚不明確，常見誘因有寄生蟲侵入、酒精刺激、肝病惡化、膽管炎等［3］。X 染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（ZFX）對人體細(xì)胞的生長、繁殖、更新可產(chǎn)生作用，能使人遠(yuǎn)離各種疾病帶來的困擾［4］。復(fù)方苦參注射液是一種抗癌藥物，由純中藥搭配調(diào)和制成，方中苦參對腫瘤細(xì)胞有抑制作用。本研究中探討了復(fù)方苦參注射液能否通過調(diào)控ZFX 的MAPKs 通路來抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的生長。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料[1]

組織蠟塊：收集2015 年7 月至2017 年7 月于醫(yī)院肝膽外科進(jìn)行手術(shù)治療且病情資料完整的120 例ICC患者的組織蠟塊，其中鄰近癌旁組織的正常膽管組織80 例，肝內(nèi)膽管結(jié)石標(biāo)本40 例。納入研究患者全身無擴(kuò)散轉(zhuǎn)移且未經(jīng)任何放射治療，其中男89 例，女31 例；年齡38～65 歲，平均（43.23±9.5）歲；淋巴轉(zhuǎn)移22 例，無淋巴轉(zhuǎn)移98 例。排除血清癌胚抗原較低患者。所有患者對該研究均知情，自愿無償參加。

試藥：ZFX 蛋白抗體（美國Abgent 公司，批號為A-AI10955）；GAPDH 抗體（批號為3777-100），PARP抗體（批號為3002-100），均購自美國Bio Vision 公司；p-JNK 抗體（武漢益普生物科技有限公司，批號為CY42771）；p-p38 抗體（美國Santa Cruz 公司，批號為SC-7973）；DAB 顯色試劑盒（上海如吉生物科技有限公司，批號為SJH1047）；TRIZOL 試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司，批號為TM180208）；CCK-8 試劑（上海滬震實(shí)業(yè)有限公司，批號為HZ2771）；Transwell 小室（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，批號為353090）；慢病毒（上海漢恒生物科技有限公司，批號為TL-738）。

1.2 方法

蛋白質(zhì)印跡（WB）法檢測ZFX 及MAPKs 通路蛋白：將ICC 組織放入新EP 管中，加入裂解液，混勻。待裂解完成后，離心操作30 min。去上清液，放入EP 管中，冰上保存待用。用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，相關(guān)步驟按說明書進(jìn)行。完成后與上樣緩沖液混合、離心、低溫保存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的數(shù)量配膠。在冰箱中取出SDS-PAGE，按說明配制需要的質(zhì)量濃度溶液，配制好后放入電泳液中，4 ℃保存。電泳后，用無水乙醇活化PVDF 膜，活化后放入超純水中。用轉(zhuǎn)模儀轉(zhuǎn)模，電壓為25 V，電流為0.8 mA。配制p-JNK，p-p38，p-ERK 一抗溶液。孵育后洗膜，用TBST 溶液清洗30 min。洗完后孵育二抗，完成后同樣用TBST 溶液清洗，方法同上。洗膜后，拍照，顯影后分析。

慢病毒shRNA 介導(dǎo)對ZFX 的干擾實(shí)驗(yàn)：在6 孔板中接種ICC 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞的密度升至50%時進(jìn)行慢病毒感染，MOI 值為20（若需加快轉(zhuǎn)染速率，可接入適量ploybrene 試劑）；細(xì)胞成對生長后用嘌呤霉素進(jìn)行篩選；癌組織細(xì)胞放入1.5 mL 離心管中，加入buffer 混勻。靜置5 min，加入氯仿震蕩，離心，用吸附柱提取總RNA，然后放入逆轉(zhuǎn)錄儀器中，按說明書設(shè)定程序；逆轉(zhuǎn)錄操作結(jié)束后，取cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增ZFX 和β-catin，置-20 ℃冰箱中保存；將實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞和熒光試劑放在冰上解凍，解凍后加入相應(yīng)試劑震蕩混合，然后放入熒光定量儀中按設(shè)定程序進(jìn)行熒光定量。基因表達(dá)水平操作按試劑盒說明書進(jìn)行，ICC 腫瘤細(xì)胞接種在6 孔板中，在低血清環(huán)境中培養(yǎng)（培養(yǎng)基12 h 后需進(jìn)行更換）。培養(yǎng)結(jié)束后，采用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，通過光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的顏色、大小，拍照后對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)［3］：用0.5%胰酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞5min，離心操作3min，轉(zhuǎn)速為800r/min。每個96 孔板放入大約5 000 個細(xì)胞，每孔加入100 μL 培養(yǎng)基，讓細(xì)胞在培養(yǎng)液中迅速繁殖。當(dāng)繁殖密度為40%時，更換培養(yǎng)液，在37 ℃及5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)，到待測時間點(diǎn)時，加入CCK-8 試劑，每空加入約10 μL。培養(yǎng)1 h，測定吸光度值，波長為450 nm。

免疫組化染色法檢測ICC 細(xì)胞中ZFX 蛋白分布：免疫組化染色采用DAB 顯色，操作步驟按試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行。

Transwell 法檢測ICC 細(xì)胞遷移能力：用培養(yǎng)基稀釋實(shí)驗(yàn)所需的Matrigel 膠，待濃度下降至原來的1/5 時，用滴管取40 μL 放入Transwell 中，在37 ℃環(huán)境下等待約1 h 孵育完成。用干細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整濃度后置37 ℃及5%CO2中孵育24 h。計算ICC 細(xì)胞的數(shù)量和占比。

2 結(jié)果

2.1 ZFX 蛋白在ICC 癌組織中的表達(dá)

與癌旁組織中的正常肝細(xì)胞相比，癌組織中的mRNA含量較高。與癌旁組織中ZFX 蛋白表達(dá)水平相比，癌組織中的明顯更高。癌旁組織在染色后，出現(xiàn)陽性區(qū)域。ICC 組織染色情況顯示，75%癌組織存在高表達(dá)狀態(tài)，而癌旁組織中ZFX 蛋白高低表達(dá)無明顯差異。詳見圖1。

2.2 抑制ZFX 表達(dá)對肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞生長能力的影響

shRNA 的導(dǎo)入顯著抑制了ZFX 蛋白的表達(dá)；正常培養(yǎng)條件下，ZFX 蛋白的干擾不會影響LM3 和RBE 細(xì)胞的生長；在無糖環(huán)境下，干擾細(xì)胞和對照細(xì)胞的增殖能力減弱；在低血清濃度和干擾ZFX 細(xì)胞的條件下，膽管癌細(xì)胞增殖和存活能力受到抑制。詳見圖2。

2.3 復(fù)方苦參注射液對ZFX 的調(diào)控作用

采用腫瘤壞死因子α（TNF-α）聯(lián)合放線菌酮（CHX）刺激對照細(xì)胞和干擾ZFX 的膽管癌細(xì)胞進(jìn)行探討。單用TNF-α 處理細(xì)胞，細(xì)胞無形態(tài)改變；但經(jīng)TNF-α+CHX 處理3 h 后，細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生變化，處理6 h后對照細(xì)胞凋亡，而ZFX 干擾組細(xì)胞凋亡數(shù)量很少。聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（PARP）水平的檢測是在經(jīng)TNF-α+CHX 處理的細(xì)胞裂解液中進(jìn)行。由圖3 可見，對照細(xì)胞中PARP 比shZFX 蛋白細(xì)胞高，且差異顯著。檢測MAPKs 信號通路中關(guān)鍵蛋白p-JNK，p-p38，p-ERK 的磷酸化。結(jié)果顯示，p-JNK，p-p38，p-ERK 在干擾細(xì)胞中的磷酸化水平高于對照細(xì)胞，表明ZFX 蛋白在MAPKs 通路中調(diào)節(jié)細(xì)胞存活能力。其中，感受氧化應(yīng)激的p38 的活化最明顯，表明復(fù)方苦參注射液可調(diào)控ZFX 在MAPKs 通路中的表達(dá)來抑制細(xì)胞的存活能力。

圖1 ZFX 蛋白在ICC 癌組織中的表達(dá)［6］

圖2 抑制ZFX 蛋白表達(dá)對膽管癌細(xì)胞在不同培養(yǎng)環(huán)境中生長能力的影響

圖3 ZFX 蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞存活可能通過影響MAPKs 信號通路

3 討論

鋅指蛋白基因家族是人類基因家族中不可缺少的一員［5］，主要由X 染色體編碼而成。ZFX 屬鋅指蛋白家族，與ZFT 及ZFA 為同一家族，其在結(jié)構(gòu)上非常相似［6］。ZFX 內(nèi)部含有多個C2H2結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)擁有細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、核定位序列和DNA 結(jié)合點(diǎn)［7］，具有保守性。ZFX 通過與鋅離子結(jié)合成“手指”狀，使基因在細(xì)胞、人類胚胎發(fā)育、造血干細(xì)胞自我更新中有重要作用［8-9］。ZFX 在參與干細(xì)胞自我更新的同時，可將癌細(xì)胞變大變多，加速其增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)癌癥惡化，導(dǎo)致患者病情惡化，影響預(yù)后［10-11］。但通過下調(diào)細(xì)胞MAPKs通路使ZFX 基因表達(dá)受阻，使ICC 細(xì)胞無法在體內(nèi)外增殖［12-14］。

復(fù)方苦參注射液可通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞的免疫功能來抑制和殺死腫瘤細(xì)胞。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可通過影響端粒酶作用［15-16］來發(fā)揮上述功能，尤其對T 細(xì)胞作用極明顯［17］。ICC 在早期無明顯癥狀，患者發(fā)現(xiàn)并確診為該病時已錯過最佳治療時期［18-19］。由于淋巴組織細(xì)胞轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散速度快，常規(guī)治療和手術(shù)對其無決定性作用，因此大部分患者經(jīng)手術(shù)治療的預(yù)后效果不佳［20］。

本研究結(jié)果顯示，在ICC 癌組織中ZFX 表達(dá)水平很高，癌旁組織中也有表達(dá)，但明顯低于癌組織。干擾ZFX 的細(xì)胞在低血清環(huán)境下?lián)碛休^高的繁殖能力；在低糖環(huán)境下，ZFX 蛋白生長狀況較差，表明糖是ICC 細(xì)胞生長的必備條件。平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示，ZFX 可抑制細(xì)胞凋亡，表明ZFX 蛋白對細(xì)胞凋亡有調(diào)節(jié)作用。信號通路MAPKs 研究結(jié)果顯示，在ZFX 蛋白干擾情況下，p38 在感受氧化應(yīng)激條件下蛋白活性異常增強(qiáng)，提示干擾ZFX 蛋白細(xì)胞在不良環(huán)境下更有存活優(yōu)勢。

本研究中，將ICC 細(xì)胞置低糖含量、低血濃度的培養(yǎng)環(huán)境下，以探討ZFX 蛋白的功能。雖然實(shí)驗(yàn)條件仍有不足，但對下一步的研究有較大參考意義。本研究中探討了抑制ZFX 的表達(dá)對ICC 細(xì)胞的影響，但并未研究增加ZFX 后的效果，可在今后的研究中繼續(xù)觀察。

綜上所述，ZFX 在ICC 中處于高表達(dá)狀態(tài)，復(fù)方苦參注射液通過對ZFX 在MAPKs 信號通路中的控制，可有效抑制ICC 細(xì)胞的生長。ZFX 可能是ICC 的潛在新型生物治療靶點(diǎn)。