多指標正交試驗優選葆腎合劑最佳提取工藝*

馮子芳，袁曉航，陳曉偉，費倩倩，費逸明

（南京中醫藥大學附屬無錫市中醫醫院，江蘇 無錫 214000）

葆腎合劑是治療早中期慢性腎臟病的經驗方，由芡實、黃芪、石韋、金櫻子、覆盆子等組方，補腎兼顧健脾，以補后天而實先天，固攝之時不忘清利，攝而不滯，利而不傷。中藥制劑通過多成分、多靶點協同發揮整體藥效，因此，多指標綜合評分是優化提取工藝的重要方法［1-2］。芡實益腎固攝［3-4］，黃芪益氣固攝，米仁根清利濕熱，但相關研究少，故不選擇其作為含量測定的成分。黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷為其有效成分，相關檢測手段成熟，分離度好［5-7］。覆盆子中的鞣花酸、石韋中的綠原酸均為藥材主要有效成分，理化性質穩定。故選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸、綠原酸作為含量測定指標成分。本試驗中以有效成分含量和浸膏得率為考察指標，采用多指標綜合評分方法［8］優選最佳提取工藝，明確葆腎合劑的物質基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀，包括DAD 二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；BSA224S-CW 型電子天平（德國Sartorius 公司，精度為十萬分之一）；KQ-100 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號為111920-201606），鞣花酸對照品（批號為111959-201602），綠原酸對照品（批號為110753-201817），均購自中國食品藥品檢定研究院；中藥飲片（產品信息見表1）經無錫市中醫醫院副主任中藥師胡敏敏鑒定為合格品；葆腎合劑（醫院制劑，批號分別為191201，191202，191203）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 中藥飲片產品信息

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：WatersXbridgeC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫，0～10 min 時92%B，10～12 min 時92%B→89%B，12～50 min 時89%B；檢測波長：326 nm（綠原酸），254 nm（鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷），采用雙波長檢測；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰、鞣花酸峰和綠原酸峰與其他峰達基線分離。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸和綠原酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷32 μg/mL、鞣花酸157.8 μg/mL、綠原酸53 μg/mL的混合對照品溶液。精密量取3 批樣品（批號分別為191201，191202，191203）1.5 mL，置5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲（功率為100 W，頻率為40 kHz）10 min，放冷，加甲醇定容，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。按葆腎合劑制備工藝，分別制備缺黃芪、缺覆盆子、缺石韋的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密移取上述混合對照品溶液適量，加甲醇溶解，稀釋成不同質量濃度的混合對照品溶液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，分別精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以各對照品質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線。結果見表2。

表2 線性關系考察結果

精密度試驗：取同一對照品溶液適量，連續進樣6 次，記錄毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸和綠原酸的峰面積。結果的RSD 分別為0.44%，0.27%，0.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為191202）適量，依法平行制備6 份供試品溶液。精密吸取10 μL 分別進樣測定。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸和綠原酸峰面積的RSD 分別為1.72%，2.09%，1.42%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取重復性試驗項下同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，16 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，每次10 μL。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸和綠原酸峰面積的RSD 分別為0.79%，1.98%，2.63%（n=6），表明供試品溶液在16 h 內穩定。

加樣回收試驗：精密量取樣品（批號為191202）0.75 mL，按1 ∶1（供試品溶液和混合對照品溶液中有效成分質量比）精密加入混合對照品溶液0.5 mL，依法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸和綠原酸的平均加樣回收率分別為98.15%，97.08%，97.82%，RSD 分別為2.51%，2.19%，2.52%（n=6）。

2.2 正交試驗設計

試驗方案：按處方量稱取全方藥材，共72.5 g，分別取9 份。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸和綠原酸的量為有效成分指標，采用正交設計試驗L9（34），考察煎煮時間（因素A）、煎煮次數（因素B）、加水量（因素C）和浸泡時間（因素D）對提取效果的影響，因素水平見表3。按正交試驗方案，過濾、合并提取液，濾液濃縮至200 mL，得9 個正交試驗的樣品溶液。

浸膏得率測定：精密量取樣品溶液25 mL，置干燥至恒定質量的蒸發皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥至恒重。結果見表4。

表3 正交試驗因素水平表

表4 水提工藝正交試驗結果

有效成分含量測定：依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別測定9 份正交試驗供試品溶液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸和綠原酸含量，各成分的質量分數以各單味藥材投料量計，如鞣花酸質量分數=鞣花酸提出量（mg）/覆盆子投料量（g）。結果見表4。

綜合評價及結果分析：以有效成分的質量分數和浸膏得率進行綜合評分，評分時以各指標的試驗最大值為參照，將數據進行歸一化，再給以不同權重［9］，參考君臣佐使分配權重，綜合評分=（樣品浸膏得率/樣品中最大浸膏得率）×30% ×100+（樣品毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量分數/樣品中最高毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量分數）×30% ×100+（樣品鞣花酸質量分數/樣品中最高鞣花酸質量分數）×20% ×100+（樣品綠原酸質量分數/樣品中最高綠原酸質量分數）×20% ×100，綜合評分越高，表明提取效果越好。以綜合評分對試驗結果進行直觀分析和方差分析［10］，結果見表4 和表5。由表4 可見，各因素影響順序為煎煮次數＞煎煮時間＞浸泡時間＞加水量；A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，D1＞D3＞D2，優選水平組合為A3B3C3D1。由表5 可見，煎煮次數對提取影響顯著（P＜0.05），而加水量、煎煮時間和浸泡時間均無顯著影響。故確定最佳工藝為加10 倍量水，浸泡30 min，提取3 次，每次2.0 h。

表5 方差分析結果

2.3 驗證試驗

為驗證工藝的合理性和穩定性，需進行驗證試驗［11］。按處方比例稱取3 份藥材72.5 g，加10 倍量水浸泡30 min，回流提取3 次，每次2.0 h，合并濾液，濃縮至200 mL。測得浸膏得率和毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸、綠原酸含量見表6。毛蕊異黃酮葡萄糖苷、鞣花酸和綠原酸含量的RSD 分別為1.66%，0.79%，2.10%（n=3），表明工藝穩定可行、重復性好。

表6 最佳工藝驗證試驗結果（n=3）

3 討論

多指標綜合評價是優化中藥復方提取工藝的重要手段，設計正交試驗優化提取工藝時，根據影響因素對提取工藝的貢獻大小分配不同的權重系數［12-13］。黃芪為方中臣藥，而毛蕊異黃酮葡萄糖苷為《中國藥典》規定的含量測定成分，給予其30%的權重；覆盆子中鞣花酸類化合物具有抗氧化、抗菌等作用［14］，給予20%的權重；石韋中綠原酸有抗菌、降壓等作用［15］，給予20%的權重；同時，浸膏得率也是提取工藝考察的重要指標，故將其權重設為30%。這既保證了數據指標的全面性，又根據各指標的影響程度給予了不同的側重，保證分析結果合理、科學［16］。

通過查閱文獻及多次預試驗摸索，本試驗中采用雙波長切換的方法，實現了同時測定葆腎合劑中3 種有效成分。通過對比不同流動相系統對分離效果的影響，選擇了乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液等流動相。結果表明，選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫時，所測成分各峰與其他峰有良好的分離度。利用3 種不同品牌的色譜柱Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），YMC-Pack ODS-A C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對3 種成分進行了含量測定，分離度較好。經方法學考察證實，該方法可達到有效成分分離測定的要求，且準確、可靠。

在葆腎合劑提取工藝的試驗研究中，充分考慮了君臣佐使的配伍原則、主要成分的化學性質及規模化生產的要求，采用多指標綜合評分法，優選最佳提取工藝，并進行了驗證，避免了單一因素對中藥復方提取影響的局限性和片面性。