水黃花質量標準研究*

馬 雪，劉春花，王愛民，王永林，李勇軍△

（1. 貴州醫科大學民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心·省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 2. 貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004）

黔產苗藥水黃花為大戟科大戟屬植物黃苞大戟Euphorbia sikkimensis Boiss. 的新鮮或干燥全株［1］，又名刮金板、水楊柳、五虎下西川，主要分布于廣西、貴州、湖北、四川、云南等地［2-3］，有利尿逐水、清熱解毒等功效，主治水腫、水臌、疥瘡等［4-5］。目前，對水黃花的研究主要圍繞其化學成分展開，分離得到的化合物主要有黃酮類、萜類、酚類、甾體、脂肪酸類等［6-11］。現代藥理活性方面，主要對化學成分進行了抗人類免疫缺陷病毒（HIV）、抗血管生成活性研究［7-8］。水黃花為貴州省民間常用民族藥，但2003 年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》中未收載該品種。現有研究主要集中在重金屬檢測、含量測定及指紋圖譜研究方面［12-14］，其質量標準不完善，不能有效地控制該藥材的質量和安全性。本研究中通過性狀、顯微鑒別、薄層色譜法對水黃花進行鑒別，同時還通過常規檢查、浸出物測定，以水黃花主要成分之一槲皮苷作為指標成分進行含量測定，以期建立完善的質量標準，為水黃花的深層次開發和利用提供科學依據。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

50i 型顯微鏡及DS-Fi2 型顯微成像系統（日本尼康公司）；Reprostar 3 型瑞士卡瑪薄層色譜成像系統（瑞士CAMAG 公司）；Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；島津Prominence LC-20A 型快速高效液相色譜儀（島津公司）；EL204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為萬分之一）；WPMP-Ⅱ-20 型實驗室超純水機（四川沃特爾水處理設備有限公司）；CQ-250A-ST 型超聲波清洗儀（上海躍進醫用光學器械廠，功率為250 W，頻率為50 kHz）；XT-A500 型多功能粉碎機（浙江省永康市紅太陽機電有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-300DE 型超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

槲皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度為90.6%，批號為11538-201606）；原植物及樣品均由貴州省食品藥品檢驗所李揚副主任鑒定為正品，藥材信息見表1，標本存放于貴州醫科大學貴州省藥物制劑重點實驗室；對照藥材（批號為201601）由貴州醫科大學藥學院中藥民族藥標本室提供；所有試劑均為分析純。

表1 水黃花藥材信息

2 方法與結果

2.1 性狀鑒別

根據鑒定，水黃花主根為圓柱形；棕褐色；莖枝為圓柱形，直順，彎曲少，表面灰綠色，光滑，易折斷，斷面不平坦；葉對生，完整葉片狹長呈披針形，長6～10 cm，寬1～2 cm，先端鈍圓，基部急狹，全緣光滑，多延主脈縮卷成條狀，表面黃綠色。詳見圖1。氣微，味苦。

圖1 水黃花藥材

2.2 顯微鑒別（切片）

根橫切面：木栓細胞數列，栓內層為10 余列薄壁細胞，內含淀粉粒；韌皮部較窄；形成層成環；木質部發達，均木化，占根的大部分，導管單個散在，或多數相聚徑向排列，射線寬廣。詳見圖2 至圖4。

葉橫切面：上表皮細胞由1 列長方形細胞構成，外壁突起；下表皮細胞較小，有乳頭狀或絨毛狀突起；柵欄細胞長柱形，1 列；海綿組織細胞類圓形，4～8 列；中脈維管束外韌型，導管放射狀排列，中脈上、下表皮處有1 列至數列厚角組織細胞。詳見圖5。

圖2 水黃花根橫切面（×100）

圖3 薄壁細胞中含淀粉粒（×40）

圖4 根木質部導管（×40）

圖5 水黃花葉橫切面（ ×10）

粉末顯微特征：粉末為灰綠色至灰褐色。葉表皮細胞表面呈多角形，外壁乳頭狀或短絨毛狀突起，呈雙圓圈狀；石細胞橢圓形、長方形和類方形，直徑40～150 μm，有的壁厚10～35 μm，孔溝不明顯，有的可見紋孔；木栓細胞類長方形或類多角形，內含棕色物；淀粉粒多見，單粒類球形，復粒由2～4 分粒組成，有的聚集成團，臍點多為點狀，可見“一”字狀，直徑10～40 μm；分泌道碎片易見，含黃棕色分泌物。導管為具緣紋孔、梯紋和螺紋，直徑10～80 μm；纖維成束或散在，壁厚，可見紋孔。詳見圖6。

圖6 水黃花粉末顯微特征圖

2.3 薄層色譜鑒別

取樣品粉末0.5 g，加乙醇10 mL，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL 使其溶解，作為供試品溶液。另取水黃花對照藥材0.5 g，同法制備對照藥材溶液。照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法試驗，吸取上述溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 板上，以乙酸乙酯-石油醚（60～90 ℃）-甲酸（2 ∶1 ∶0.05，V/ V/ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點。色譜圖見圖7。

圖7 不同批次水黃花藥材薄層色譜圖

2.4 水分、總灰分和浸出物測定

水分：照2015 年版《中國藥典（四部）》通則0832 水分測定法（第二法 烘干法）測定，取樣品粉末（過2 號篩）2 g，精密稱定，平鋪于干燥恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，精密稱定，開啟瓶蓋在105 ℃干燥5 h，蓋好瓶蓋，移至干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱定質量，至連續2 次稱得質量的差異不超過5 mg 為止，根據減失的質量，計算供試品的水分（%）。結果4 批水黃花藥材水分含量為10.80%～11.10%，詳見表2。

總灰分：照2015 年版《中國藥典（四部）》通則2302灰分測定法測定，取樣品粉末3 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質量（精度為0.01 g），緩緩熾灼，避免燃燒，至完全炭化時，逐漸升高溫度至550 ℃，使完全灰化并至恒重，根據殘渣質量，計算供試品中總灰分的含量（%）。結果4 批水黃花藥材總灰分含量為5.29%～5.83%，詳見表2。

表2 水黃花藥材中水分、總灰分、水溶性浸出物含量測定結果（%，n=2）

浸出物含量：水黃花民間習用方法為水煎煮或搗碎，故選擇以水為溶劑進行水溶性浸出物研究，以浸出物作為本品質量控制指標之一。取樣品粉末（過2 號篩）2 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，精密加水50 mL，照2015 年版《中國藥典（四部）》通則2201 浸出物測定法中水溶性浸出物熱浸法測定，以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量。結果4 批水黃花藥材水溶性浸出物含量為19.20%～20.33%，詳見表2。

2.5 槲皮苷含量測定

2.5.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Venusil XBP C18（L）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：258 nm；進樣量：10 μL。理論板數以槲皮苷峰計應不低于5 000。在此色譜條件下的色譜圖見圖8。

圖8 高效液相色譜圖

2.5.2 溶液制備

取水黃花藥材粉末（過3 號篩）約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率為200 W，頻率為40 kHz）1 h，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，制成每1 mL 含槲皮苷0.521 9 mg 的溶液，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，配制成質量濃度為0.024 9 mg/mL 的對照品溶液。

2.5.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密量取對照品貯備液適量，置10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成質量濃度為0.005 0，0.024 9，0.049 8，0.074 7，0.089 6 mg/mL的系列對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。得回歸方程Y=515.03 X-0.079 3（r=0.999 9）。結果表明，槲皮苷質量濃度在0.005 0～0.089 6 mg/mL 范圍內與峰面積線性關系良好。

耐用性試驗：取水黃花藥材（批號為201513）粉末1 g，共3 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，分別調整流動相比例［乙腈-0.1%磷酸溶液（19 ∶81，V/ V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）和乙腈-0.1%磷酸溶液（21 ∶79，V/ V）］、pH［乙腈-0.05%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）和乙腈-0.15%磷酸溶液（20 ∶80，V/ V）］、流速［0.9，1.0，1.1 mL/min］、色譜柱［（Puls C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Venusil XBP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］、檢測波長（256，258，260 nm）、柱溫（32，35，38 ℃）、儀器［UlMate 3000 型（雙三元）、UlMate3000 型、島津Prominence LC-20A型］，進行試驗，并計算不同條件下供試品溶液中槲皮苷的含量。結果的RSD 低于2.0%（n=9），表明該方法耐用性良好。

重復性試驗：分別取水黃花藥材（批號為201513）粉末0.5，1.0，1.5 g，各3 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，并計算不同質量濃度的供試品溶液中槲皮苷的含量。結果3 個不同質量濃度供試品溶液中槲皮苷的平均含量為0.19%（按干燥品計），RSD=3.02%（n=9），表明方法重復性良好。

中間精密度試驗：以不同的試驗人員（2 名），在不同時間按上述方法分別取水黃花藥材（批號為201513）粉末1 g，各3 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果槲皮苷含量的RSD=2.86%（n=6），表明方法的中間精密度良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，8 h 時按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果槲皮苷峰面積的RSD 為0.49%（n=5），表明供試品溶液在8 h 內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的水黃花藥材（批號為201513）粉末0.5 g，精密稱定，共9 份，分別按稱量樣品被測定成分的樣品含量加入50%，100%，150%，各3 份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表3。

表3 槲皮苷加樣回收試驗結果（n=9）

2.5.4 樣品含量測定

取各批次水黃花藥材粉末1 g，各2 份，精密稱定，分別依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，計算含量。結果見表4。

表4 水黃花藥材含量測定結果（%，n=2）

3 討論

水黃花藥材作為貴州省民族藥廣泛使用，目前尚無完整質量控制方法。因此，本研究中首次從根橫切面、葉橫切面及粉末3 方面對水黃花藥材進行了顯微鑒別，其顯微特征明顯，為水黃花藥材生藥學鑒別提供了科學基礎；其次，在薄層色譜鑒別研究中考察了不同廠家的薄層色譜板（青島海洋硅膠G 板、青島鼎康硅膠G 板和煙臺江友硅膠HSG 板）、不同溫度（10，25，30 ℃）、不同相對濕度（32%，58%，72%）、穩定性（0，1，2，3 d）對薄層色譜鑒別方法進行耐用性試驗。結果顯示，在不同條件下，薄層色譜方法均可鑒別水黃花藥材，表明該方法可行。含量測定試驗中，對供試品溶液的提取方法（超聲提取，回流提取，索式提取），提取溶劑（甲醇，75%甲醇，50%甲醇，25%甲醇，水，95%乙醇，75%乙醇，50%乙醇，25%乙醇）及提取時間（0.5，1.0，2.0 h）等進行了考察。結果顯示，采用甲醇超聲處理1.0 h 為制備供試品溶液的最佳方法。

綜上所述，本研究中通過性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別、常規檢查、浸出物及含量測定方法建立了水黃花藥材的質量標準，可有效保證水黃花藥材的質量，為水黃花藥材的廣泛使用及開發提供了理論依據。