不同品種(品系)棉花對鹽脅迫的生理響應及耐鹽性評價

石 婧， 劉東洋， 張鳳華

(1.石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832003； 2.石河子大學農學院/綠洲生態農業兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003)

鹽漬化是全球性的土壤環境問題，當前由于不合理的灌溉制度和施肥措施等，導致土壤鹽漬化程度加劇，從而降低了農作物產量[1]。全世界大約有4×108hm2鹽堿地，分布在一百多個國家[2]，其中中國大約有9.2×107m2鹽堿地，并且面積還在日益擴大[3]。如何開發利用這些土地資源是目前中國乃至世界面臨的難題。棉花作為重要的經濟作物，常常作為鹽堿地開墾過程中的先鋒作物[4]，盡管棉花被認為是中度耐鹽作物，但是其耐鹽程度仍然受到遺傳和發育階段的影響[5]。因此，研究棉花在鹽堿地環境下的自我保護機制是篩選耐鹽棉花品種的重要途徑之一。

目前已有較多關于棉花耐鹽性的研究，例如有研究發現，在鹽脅迫下，棉花幼苗中的可溶性糖含量、可溶性蛋白質含量、丙二醛含量均有所增加[6]，棉花還可通過合成脯氨酸(Pro)來提高細胞滲透壓[7]，并且在鹽脅迫下棉花植株體內的抗氧化系統發生了變化，棉花植株通過提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性和過氧化氫酶(CAT)活性來維持膜結構和功能的穩定性[8-9]。也有研究發現，在鹽脅迫環境下，棉花的保護酶活性有所下降[10]。在鹽脅迫下，由于存在大量Na+，往往造成外部高Na+濃度、低K+濃度的離子不平衡現象，細胞一般通過保持組織內較高的K+/Na+來維持自身的穩態。相關研究發現，耐鹽性較強的棉花品種往往比耐鹽性弱的棉花品種具有更高的K+/Na+[11-12]。Na+的大量積累同樣會造成凈光合速率的降低[13]，然而也有研究者認為，凈光合速率的降低主要受氣孔因素和非氣孔因素的影響[14]。由于棉花耐鹽性受滲透調節物質、離子平衡、氧化應激、光合特性等多方面的影響，并且其中某些特定組成部分可能起著至關重要的作用，因此使用某些單項指標很難準確全面地比較棉花品種間的耐鹽性，需要通過多指標綜合評價的方法來篩選耐鹽棉花品種，而主成分分析法與灰色關聯度分析法的結合能夠客觀、綜合地評價棉花的耐鹽性[15-16]。

本研究采用田間微區控制試驗，分析鹽脅迫條件下耐鹽棉花與鹽敏感棉花在滲透調節、離子平衡、氧化應激和光合作用等方面的差異，運用主成分分析法和灰色關聯度分析法對4個棉花品種(品系)的耐鹽性進行綜合評價，以期篩選出鑒定棉花耐鹽性的重要指標，為開發適應鹽漬化土壤的耐鹽棉花品種(品系)和在生產實際上更加簡便地評價棉花的耐鹽性提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況與試驗材料

本試驗在新疆生產建設兵團第八師石總場四分場6連進行，該區域屬于典型的溫帶大陸性氣候，年平均氣溫為7.5～8.2 ℃，年平均降水量為180 mm，年平均蒸發量為1 600 mm，年平均日照時數為2 784 h，年平均無霜期為166 d，≥0 ℃積溫為3 918 ℃。試驗地土壤中度鹽漬化，土壤透氣、透水性差。試驗地基礎理化性質如下：pH值為8.46，電導率為801.27 μS/cm，全鹽含量為10.23 g/kg，堿解氮含量為54.25 mg/kg，速效磷含量為4.82 mg/kg，速效鉀含量為293.00 mg/kg，有機質含量為3.98 g/kg。供試棉花品種(品系)為耐鹽品種中H177、耐鹽品系中J0710與鹽敏感品種中J0102、鹽敏感品種新陸早74，前3個棉花品種(品系)及其耐鹽性數據由中國農業科學院棉花研究所提供。

1.2 試驗設計

采用田間微區試驗方法，先人工鋪膜，之后進行點播。于2019年4月29日播種，采用1膜3管6行地膜覆蓋栽培，株距為10 cm。每個棉花品種(品系)設為1個處理，每個處理設2次重復，共計8個微區，本試驗微區采用隨機區組方式排列，每個微區長2.05 m、寬2.00 m，每個微區的面積為4.10 m2，微區周圍設置0.5 m寬保護行，栽培管理措施與一般棉田一致。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 葉綠素SPAD值與光合指標的測定 于棉花出苗后5葉期測定葉綠素SPAD值及光合參數，葉綠素SPAD值用日本柯尼卡美能達SPAD-502葉綠素儀測定，光合指標用LI-6400便攜式光合儀測定，包括凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)，光照度設為1 200 μmol/(m2·s)。選擇晴朗無云的天氣進行測定，從9∶00開始，選取各小區棉花的功能葉(倒三葉)進行測定，各處理連續測定6株，取平均值。

1.3.2 生理生化指標的測定 測定棉花的葉綠素SPAD值、光合指標后進行棉花植株的取樣，將棉花植株放入裝有干冰的泡沫盒中帶回實驗室，清洗干凈后用吸水紙將其表面水分吸干，將一部分棉花植株研磨，用于測定生理生化指標，將另一部分棉花植株先于105 ℃殺青30 min，再于80 ℃烘干以測定其Na+、K+含量。

用考馬斯亮藍G-250染色法測定棉花植株中可溶性蛋白質含量；用蒽酮比色法測定棉花植株中可溶性糖含量；用茚三酮比色法測定棉花植株中脯氨酸含量；用硫代巴比妥酸比色法測定棉花植株中丙二醛含量；用氮藍四唑光還原法測定棉花植株中超氧化物歧化酶活性；用愈創木酚-過氧化氫法測定棉花植株中過氧化物酶活性；用紫外吸收法測定棉花植株中過氧化氫酶活性[17]；Na+、K+含量用離子色譜儀測定[18]。

1.4 分析方法

采用灰色關聯度分析法進行分析。按照灰色理論系統，將4個棉花品種(品系)看作1個灰色系統，每個棉花品種(品系)是該系統中的1個因素。設有i個棉花品種(品系)、j個指標，將各棉花品種(品系)的各指標構成設為比較數列Xi，各指標用k表示。其中丙二醛含量、Na+含量的測量值越小越好，采用下限效果測度變換，其他指標采用上限效果測度變換。相關計算公式如下：

(1)

式中，wj為第j個綜合指標的重要程度(即權重)，pj為棉花品種(品系)第j個綜合指標的貢獻率。

對棉花品種(品系)指標的原始數據進行無量綱化處理，采用效果測度變換，上限效果測度變換公式如下：

Lij=Xij/Xmax(Xij≤Xmax)

(2)

式中，Lij為第i個棉花品種(品系)第j個指標的標準值，Xmax為指標中的最大值，Xij構成樣本評價矩陣。

下限效果測度變換公式如下：

Lij=Xmin/Xij(Xij≥Xmin)

(3)

式中，Lij為第i個棉花品種(品系)第j個指標的標準值，Xmin為指標中的最小值，Xij構成樣本評價矩陣。按下式計算各棉花品種(品系)指標序列值與最優序列值的差[△i(k)]：

△i(k)=|1-Lij|

(4)

其他相關計算公式：

(5)

(6)

(7)

1.5 數據處理

用Excel 2017對試驗數據進行整理、繪圖并計算灰色關聯度，用SPSS 20.0軟件進行方差分析與主成分分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片滲透調節物質的影響

本研究發現，鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片可溶性蛋白質含量、可溶性糖含量和脯氨酸含量的影響有差異。由圖1A可以看出，棉花葉片可溶性蛋白質含量以鹽敏感品種新陸早74和耐鹽品系中J0710最高，兩者間無顯著差異，并且這2個棉花品種(品系)葉片可溶性蛋白質含量均顯著高于其他棉花品種，葉片可溶性蛋白質含量較高的還有耐鹽棉花品種中H177，而鹽敏感棉花品種中J0102的葉片可溶性蛋白質含量最低。由圖1B、圖1C可以看出，各棉花品種(品系)葉片可溶性糖含量與脯氨酸含量均表現出顯著差異(P<0.05)，鹽敏感棉花品種新陸早74葉片可溶性糖含量最高，并且顯著高于其他棉花品種(品系)，而鹽敏感棉花品種中J0102葉片可溶性糖含量顯著低于其他棉花品種(品系)(P<0.05)；耐鹽棉花品種中H177葉片脯氨酸含量最高，其次為耐鹽棉花品系中J0710，這2個棉花品種(品系)的脯氨酸含量均顯著高于鹽敏感棉花品種新陸早74和中J0102。

2.2 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片葉綠素SPAD值和丙二醛含量的影響

如圖2A所示，不同品種(品系)棉花葉片的葉綠素SPAD值存在差異，耐鹽棉花品系中J0710葉片的葉綠素SPAD值最高，顯著高于其他棉花品種(P<0.05)，其次為耐鹽棉花品種中H177。此外，耐鹽棉花品種(品系)的葉綠素SPAD值均明顯高于鹽敏感棉花品種，鹽敏感棉花品種中J0102葉片的葉綠素SPAD值最低。由圖2B可以看出，不同品種(品系)棉花葉片的MDA含量間存在顯著差異(P<0.05)，鹽敏感棉花品種中J0102葉片的MDA含量最高，其次為鹽敏感棉花品種新陸早74，表明鹽敏感棉花品種的膜損傷程度較為嚴重，而耐鹽棉花品種(品系)中H177、中J0710的葉片MDA含量低。

A：可溶性蛋白含量；B可溶性糖含量；C：脯氨酸含量。不同處理間標有不同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。圖1 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片滲透調節物質的影響Fig.1 Effects of salt stress on osmotic regulating substances in leaves of different cotton cultivars(strains)

A：SPAD值；B:丙二醛含量。不同處理間標有不同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。圖2 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片SPAD值及丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of salt stress on soil and plant analyzer development (SPAD) value and malondialdehyde (MDA) content in leaves of different cotton cultivars(strains)

2.3 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片光合特性的影響

本研究發現，耐鹽棉花品種(品系)和鹽敏感棉花品種間的光合特性有一定差異。由圖3A可以看出，耐鹽棉花品系中J0710葉片的Pn最高，顯著高于其他棉花品種(P<0.05)，耐鹽棉花品種中H177和鹽敏感棉花品種中J0102間的葉片Pn無顯著差異，但二者均顯著高于鹽敏感品種新陸早74。由圖3B、圖3C、圖3D可以看出，各棉花品種(品系)間在葉片Gs、Ci和Tr上的差異基本相似，均表現為耐鹽棉花品種(品系)較高，鹽敏感棉花品種較低。耐鹽棉花品種(品系)中H177和中J0710、鹽敏感棉花品種中J0102的Gs、Ci均顯著高于鹽敏感棉花品種新陸早74(P<0.05)；耐鹽棉花品種(品系)間的Tr無顯著差異，鹽敏感棉花品種間的Tr也無顯著差異,并且耐鹽棉花品種(品系)的Tr均顯著高于鹽敏感棉花品種(P<0.05)。

2.4 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片抗氧化酶活性的影響

本研究發現，不同棉花品種(品系)間的抗氧化酶活性有一定差異。由圖4A可以看出，耐鹽棉花品種(品系)中H177、中J0710和鹽敏感棉花品種新陸早74間的SOD活性無顯著差異，但均顯著高于鹽敏感棉花品種中J0102(P<0.05)。由圖4B可以看出，在POD活性方面，耐鹽棉花品系中J0710和鹽敏感棉花品種中J0102葉片的POD活性最高，兩者間無顯著差異，且兩者均顯著高于其他棉花品種(P<0.05)。由圖4C可以看出，鹽敏感棉花品種(新陸早74和中J0102)葉片中的CAT活性顯著高于耐鹽棉花品種(品系)(中H177和中J0710)(P<0.05)。

A：凈光合速率；B：氣孔導度；C：胞間CO2濃度；D：蒸騰速率。品種(品系)間標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片光合特性的影響Fig.3 Effects of salt stress on photosynthetic characteristics in leaves of different cotton cultivars(strains)

A：超氧化物歧化酶(SOD)活性；B：過氧化物酶(POD)活性；C：過氧化氫酶(CAT)活性。品種(品系)間標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花葉片抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of salt stress on antioxidant enzyme activities in leaves of different cotton cultivars(strains)

2.5 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花Na+、K+含量的影響

如表1所示，在鹽脅迫環境下，耐鹽棉花品種中H177葉片、根中Na+含量顯著高于其他棉花品種(品系)(P<0.05)，耐鹽棉花品系中J0710莖中Na+含量顯著高于其他棉花品種。耐鹽棉花品種中H177各器官中K+含量、K+/Na+均顯著高于其他棉花品種(品系)(P<0.05)，而鹽敏感棉花品種中J0102葉、莖中K+/Na+顯著低于其他棉花品種(品系)(P<0.05)，但根中K+/Na+與耐鹽棉花品系中J0710無顯著差異。

2.6 主成分分析和灰色關聯度分析

對4個棉花品種(品系)中H177、新陸早74、中J0710和中J0102受鹽脅迫后的21個指標進行主成分分析。結果表明，第1主成分(PC1)、第2主成分(PC2)和第3主成分(PC3)特征值均大于1，主成分特征值中3個成分的累積方差貢獻率達到85.63%。將原來的21個單項指標轉換為3個相互獨立的主成分，并對數據進行極差法標準化處理后，根據公式(1)計算權重。由表2可以看出，本研究測定的21個評價指標中權重系數較大的為MDA含量、SPAD值、CAT活性、Pn、Gs、Ci、Tr。

表1 鹽脅迫對不同品種(品系)棉花各器官Na+、K+含量的影響

對數據進行無量綱化處理，并根據公式(5)、公式(6)和公式(7)的計算結果得到各指標的權重。根據灰色關聯度分析方法計算得出，各指標的權重系數中較大的為可溶性蛋白質含量、SPAD值、POD活性、Pn、Gs、Ci和Tr(表2)。計算各棉花品種(品系)的灰色綜合評價值，由表3可見，4個棉花品種(品系)的關聯度為0.66～0.81，其中中H177的關聯度最高，為0.81，中J0102的關聯度最低，為0.66；根據ri′對棉花品種(品系)進行耐鹽性評價排序：中H177>中J0710>新陸早74>中J0102。

表2 不同棉花品種(品系)的單項指標權重系數

表3 供試棉花品種(品系)指標的關聯度及排序

3 討 論

3.1 不同耐鹽棉花品種(品系)滲透調節系統和抗氧化酶系統的差異

一般來說，植株能夠通過積累滲透調節物質來抵抗鹽脅迫[19]。梁曉艷等[20]研究發現，在鹽脅迫環境下，耐鹽植物品種葉片中較高的脯氨酸含量是其重要的耐鹽適應特征。在本研究中同樣發現，耐鹽棉花品種(品系)植株葉片中的脯氨酸含量顯著高于鹽敏感棉花品種，表明在鹽脅迫下耐鹽棉花中脯氨酸的積累有利于其維持較高的抗性。在本研究中還發現，耐鹽棉花品種(品系)與鹽敏感棉花品種間的滲透調節物質差異存在不一致，其中鹽敏感棉花品種新陸早74葉片中的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量顯著高于耐鹽棉花品種中H177，鹽敏感棉花品種中J0102葉片中的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量則顯著低于耐鹽棉花品種(品系)，可能是由于2種鹽敏感棉花品種對鹽的耐受性不同[21]。由于鹽脅迫造成植株中Na+過量，使得活性氧產生和積累，造成了氧化脅迫，從而加劇了膜脂過氧化產物丙二醛的積累[22]。在本研究中，耐鹽棉花品種(品系)的膜脂過氧化產物丙二醛含量顯著低于鹽敏感品種，植株在應激環境下，能夠通過SOD、POD和CAT活性的變化來提高自身的抗氧化水平以清除活性氧[23]。本試驗通過對不同棉花品種(品系)葉片中SOD活性、POD活性和CAT活性的研究發現，鹽敏感棉花品種與耐鹽棉花品種(品系)的抗氧化酶活性具有不同的變化趨勢：耐鹽棉花品種(品系)的SOD活性較高但POD活性不高，可能由于葉片中的SOD活性增大，導致超氧陰離子自由基(O2·-)更多地轉化為H2O2，從而抑制了POD活性；耐鹽棉花品種(品系)葉片中的CAT活性則顯著低于鹽敏感棉花品種，說明氧化應激方式在耐鹽棉花類型和種間存在差異[24]，也進一步說明耐鹽棉花品種(品系)和鹽敏感棉花品種抵抗鹽脅迫的方式存在差異。

3.2 不同耐鹽棉花品種(品系)光合效率的差異

本研究發現，鹽脅迫條件下鹽敏感棉花品種的光合參數(Pn、Gs、Ci和Tr)顯著低于耐鹽棉花品種(品系)，并且鹽脅迫會導致植株光合作用減弱[25]。對光合作用的影響主要體現在2個方面：氣孔因素和非氣孔因素[26]。氣孔限制會導致Ci降低，進而降低凈光合速率，而非氣孔限制一般會引起Ci升高[27]。在本研究中，鹽敏感棉花品種的Pn、Gs和Ci變化一致，說明鹽敏感棉花品種的光合速率主要受氣孔因素的影響。郭麗麗等[28]研究發現，在鹽脅迫下光合速率的下降受到氣孔和非氣孔因素影響，本研究中耐鹽棉花品種(品系)間Pn、Gs和Ci的變化并不一致。通過對非氣孔因素的研究發現，耐鹽棉花品種(品系)葉片中的葉綠素含量顯著高于鹽敏感棉花品種，并且葉綠素含量在耐鹽棉花品種(品系)間也存在顯著差異，說明耐鹽棉花品種(品系)通過提高自身的光合作用來降低鹽脅迫的損害，并且Pn的變化可能同時受到氣孔因素和非氣孔因素影響。

3.3 不同耐鹽棉花品種(品系)對離子平衡響應的差異

鹽脅迫下大量Na+的流入及K+的排出會產生離子毒害，而植株抵御離子毒害的重要途徑是通過抑制Na+向地上部分運輸并且減緩葉片中K+的流失[29-30]。在本研究中，耐鹽棉花品種中H177地下部分較其他棉花品種(品系)保持了較高的Na+含量，并且根系中的Na+含量高于地上部分，表明其根部保留了大量Na+，減少了Na+向地上部分的運輸，從而減輕了對幼苗的毒害。相關研究發現，組織中高K+/Na+是棉花耐鹽能力的一個重要鑒定指標[31]。在本研究中，耐鹽棉花品系中J0710葉、根中Na+、K+含量均顯著低于鹽敏感棉花品種新陸早74，但其地上部分的K+/Na+較鹽敏感棉花品種新陸早74高，這可能是由于植株能夠采取更有效的機制參與K+、Na+的轉運，而不是依賴于對K+、Na+的吸收能力[32-33]。在本研究中，耐鹽棉花品種(品系)和鹽敏感棉花品種各器官的K+含量和K+/Na+表現出明顯差異，總體表現為耐鹽棉花品種(品系)高于鹽敏感棉花品種，也表明耐鹽棉花品種(品系)能夠通過保持低Na+、高K+來維持自身的離子穩態。

3.4 棉花苗期的耐鹽性評價

鹽脅迫對棉花的影響表現在滲透調節、抗氧化酶活性、光合作用及離子平衡等方面[34]，為了全面準確地評價不同棉花品種(品系)的耐鹽性，應當通過與耐鹽性相關的多項指標進行綜合評價。在本研究中，通過對4個不同耐鹽性棉花品種(品系)的21個相關指標的鑒定評價發現，光合參數、SPAD值和CAT活性、POD活性在其耐鹽性評價中的權重系數較高，表明這些指標能反映棉花的耐鹽性，因此可以通過施加外源添加物等方法提高棉花的光合效率、抗氧化酶活性等增強棉花的耐鹽性[35-36]。通過主成分分析法和灰色關聯度分析法進行的棉花耐鹽性綜合評價，使得不同棉花品種(品系)的耐鹽性評價更加客觀合理，也為今后在實際生產中評價棉花的耐鹽性提供了較為方便的方法。

4 結 論

在鹽脅迫環境下，棉花通過合成較多葉綠素來維持其葉片的光合能力，同時通過維持高K+/Na+、較低的丙二醛含量來提高自身的耐鹽性。與鹽敏感棉花相比，耐鹽棉花始終保持較高的光合能力和K+/Na+。通過主成分分析法和灰色關聯度分析法進行綜合評價發現，耐鹽性評價指標中的光合指標、SPAD值和抗氧化酶活性可作為重要的鑒定指標，并且鑒定結果表明，供試的棉花品種(品系)中，中H177在苗期的耐鹽性較好。