藜麥CqCIPK7基因的克隆與表達(dá)分析

時(shí)丕彪， 洪立洲， 王 軍， 費(fèi)月躍， 王偉義， 呂遠(yuǎn)大， 顧閩峰

(1.鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，江蘇 鹽城 224049； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，江蘇 南京 210014)

土壤鹽堿化不利于作物生長，從而影響作物產(chǎn)量，嚴(yán)重限制農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-4]。過量的鹽分會(huì)引起離子和滲透脅迫，嚴(yán)重危害植物的光合作用、生長發(fā)育、能量代謝和蛋白質(zhì)合成[5-7]。植物主要通過感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號(hào)來響應(yīng)鹽脅迫。在長期的進(jìn)化過程中，植物形成了多種復(fù)雜的機(jī)制來保護(hù)自己免受鹽脅迫的危害，包括限制Na+吸收、增加Na+外排以及液泡內(nèi)Na+的區(qū)隔化，還可以控制Na+從根部向植株地上部的運(yùn)輸[8-9]。研究者還發(fā)現(xiàn)，維持細(xì)胞質(zhì)中K+/Na+的穩(wěn)定比值對(duì)植物細(xì)胞功能的發(fā)揮非常重要[10]。

Ca2+作為第二信使，在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用[11]。植物體內(nèi)含有多種Ca2+調(diào)節(jié)蛋白，包括鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白(CBL)和鈣依賴蛋白激酶(CDPK)。CBL是一種植物特異基因，編碼一種類似于酵母和動(dòng)物細(xì)胞蛋白磷酸酶的鈣調(diào)蛋白B亞基的蛋白質(zhì)[12]。CBL在擬南芥中被認(rèn)為是鹽脅迫反應(yīng)的重要參與者[13]，它能與CIPK(CBL-interacting protein kinase)C末端保守的NAF/FISL結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合[14]。CIPK是植物所特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與非生物脅迫相關(guān)[2]。CIPK蛋白通常含有一個(gè)激酶激活結(jié)構(gòu)域、一個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域以及連接二者的連接結(jié)構(gòu)域[15]。隨著生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)的不斷向前發(fā)展，越來越多物種的CIPK基因被挖掘出來。迄今，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)26個(gè)AtCIPK[16]，水稻中有31個(gè)OsCIPK[17]，玉米中有43個(gè)ZmCIPK[18]，高粱中有32個(gè)SbCIPK[19],甘蔗中有8個(gè)ScCBL[20]，油菜中有23個(gè)BnaCIPK[21]等。

CIPK在植物響應(yīng)外部刺激的反應(yīng)中起著極其重要的作用。SOS(Salt overly sensitive)通路是鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中最重要的通路之一[22]，比如AtCIPK24與AtCBL4的互作，直接作用于Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtSOS1 (AtNHX7)，能夠增強(qiáng)擬南芥的耐鹽能力[23]，AtCBL10-AtCIPK24復(fù)合物使地上部組織免遭鹽害[24]。擬南芥atcipk21突變體表現(xiàn)出較弱的耐鹽性[25]。小麥TaCIPK14和TaCIPK29分別增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性和耐寒性[26-27]。TaCIPK25過表達(dá)減弱了小麥的耐鹽性[4]。將MdCIPK6L基因轉(zhuǎn)入蘋果和擬南芥中均能增強(qiáng)其對(duì)鹽、旱和冷脅迫的抗性[28]。將玉米ZmCIPK16轉(zhuǎn)入擬南芥sos2突變體能促進(jìn)AtSOS1基因的表達(dá)，從而提高其耐鹽性[29]。二穗短柄草BdCIPK31基因則通過ABA信號(hào)通路增強(qiáng)植株對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性[30]。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是一種闊葉草本植物，不僅具有極其豐富的營養(yǎng)價(jià)值，還具有對(duì)各種環(huán)境條件適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)[31]。然而，藜麥作為一種耐鹽作物，我們對(duì)其耐鹽機(jī)理尚不清楚。藜麥參考基因組的公布[32]以及關(guān)于藜麥鹽堿性轉(zhuǎn)錄組研究的完成都為挖掘藜麥耐鹽基因及解析其耐鹽機(jī)理提供了重要的參考價(jià)值，有望加快耐鹽藜麥育種進(jìn)程。本研究從藜麥中克隆CqCIPK7基因的cDNA全長序列，并對(duì)該基因及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，利用RT-qPCR(Real-time quantitative PCR)技術(shù)分析其在藜麥不同組織器官及鹽脅迫下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究CqCIPK7的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

藜麥材料為本課題組保存的R-64。主要試劑為RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)、PrimeScript TM RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、Trans2K DNA Marker (TransGen Biotech)、Gel Extraction Kit (OMEGA)、Fast Start Universal SYBR Green Master (Roche)。

1.2 材料處理

將藜麥種子用3% H2O2殺菌消毒后于發(fā)芽盒進(jìn)行催芽，待種子萌發(fā)子葉平展時(shí)進(jìn)行水培處理。六葉一心期挑選長勢(shì)一致的幼苗用300 mmol/L NaCl溶液處理，在處理0 h、6 h、12 h和24 h后取藜麥的根部組織，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于RNA提取，每個(gè)處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，以處理0 h的樣品作為對(duì)照。

1.3 藜麥總RNA提取及cDNA合成

用植物總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，包括組織特異性材料的種子、根、莖、葉、花序、幼苗及經(jīng)NaCl處理的幼苗的根。基因克隆和表達(dá)分析所用的cDNA模板均按照PrimeScript TM RT-PCR Kit試劑盒說明書合成。

1.4 CqCIPK7基因的克隆

根據(jù)藜麥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及UniGene功能注釋結(jié)果獲得CIPK7基因堿基序列，設(shè)計(jì)基因特異性引物CqCIPK7-cDNA-F和CqCIPK7-cDNA-R(表1)，以藜麥葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系總體積50 μl，含2×TaqMaster Mix 25 μl，cDNA模板1 μl，正反向引物各1 μl，ddH2O 22 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，連接到pMD18-T 載體上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。菌液PCR驗(yàn)證為陽性單菌落的菌液送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 CqCIPK7基因的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線分析CqCIPK7基因的開放閱讀框架并翻譯成氨基酸，利用ExPASy ProtParam工具(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)等，利用NCBI CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，用GORIV (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，用ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的親水性，用SignalP-5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析，用PSORT (http://psort1.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。使用ClustalX 2.0軟件對(duì)CqCIPK7的氨基酸序列及NCBI上下載的其他物種同源CIPK7蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。使用MEGA 5.05軟件，采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ) (bootstrap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 CqCIPK7基因克隆與定量表達(dá)所用引物序列

1.6 CqCIPK7基因表達(dá)分析

根據(jù)CqCIPK7基因的堿基序列設(shè)計(jì)RT-qPCR引物CqCIPK7-Q-F和CqCIPK7-Q-R(表1)，CqEF1a為內(nèi)參基因[33]，進(jìn)行定量表達(dá)分析。PCR反應(yīng)體系為20.0 μl：10.0 μl SYBR green supermix、2.5 μl cDNA、正反向引物各1.0 μl、5.5 μl ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法[34]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 CqCIPK7基因克隆與序列分析

利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，從藜麥葉片中克隆得到CqCIPK7基因1 407 bp的cDNA全長序列，GenBank登錄號(hào)為XP_021744082.1。序列分析結(jié)果表明該基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，不含有5′端或3′端非翻譯區(qū)，含有一個(gè)1 407 bp的開放閱讀框架，編碼468個(gè)氨基酸。

2.2 CqCIPK7蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 CqCIPK7蛋白的理化性質(zhì)分析 利用ExPASy軟件分析CqCIPK7蛋白的氨基酸序列，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)分子式為C2 245H3 603N655O670S26，相對(duì)分子質(zhì)量為5.13×104，理論等電點(diǎn)為9.33；在構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，絲氨酸含量最多(10.3%)，其次是甘氨酸(9.2%)和亮氨酸(8.8%)，半胱氨酸(1.9%)和色氨酸(1.3%)含量最少；脂肪族指數(shù)為80.66，不穩(wěn)定系數(shù)為47.06。預(yù)測(cè)CqCIPK7蛋白為一種不穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)。

2.2.2 CqCIPK7蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)在第28～290個(gè)氨基酸之間含有一個(gè)S_TKc保守結(jié)構(gòu)域，為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶區(qū)；在第341～364個(gè)氨基酸之間含有一個(gè)NAF保守結(jié)構(gòu)域，為與CBLs互作的調(diào)控結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CqCIPK7蛋白可能定位于葉綠體基質(zhì)、葉綠體類囊體膜、葉綠體類囊體空間和微體(過氧化物酶體)，概率分別為91.8%、70.4%、67.1%和30.0%。

2.2.3 CqCIPK7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CqCIPK7蛋白主要由α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中無規(guī)則卷曲比例最大，為49.15%，其次是α螺旋占29.70%，延伸鏈比例最小，為21.15%。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，CqCIPK7蛋白的空間結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，含有少量α螺旋和延伸鏈。

2.2.4 CqCIPK7蛋白的親水性分析 利用ProtScale在線分析CqCIPK7蛋白的親水性，結(jié)果顯示，在第226位具有最高分值，為3.111，疏水性最強(qiáng)；在第371位和372位具有最低分值，為-3.644，親水性最強(qiáng)。該蛋白質(zhì)的親水性平均值為-0.315，表明CqCIPK7蛋白是一種親水性蛋白質(zhì)。同時(shí)，此蛋白質(zhì)沒有信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白質(zhì)。

2.2.5 CqCIPK7蛋白的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫通過BLASTP比對(duì)得到菠菜SoCIPK7 (Spinaciaoleracea, XP_021838560.1)、甜菜BvCIPK7 (Betavulgaris, XP_010669683.1)、蘋果MdCIPK7(Malusdomestica, NP_001315663.1)、青蒿AaCIPK7 (Artemisiaannua, PWA86146.1)、棉花GhCIPK7 (Gossypiumhirsutum, XP_016729098.1)、擬南芥AtCIPK7 (Arabidopsisthaliana, NP_188940.1)、黃瓜CsaCIPK7 (Cucumissativus, KGN56923.1)、番茄SlCIPK7(Solanumlycopersicum, XP_004247630.1)、核桃JrCIPK7 (Juglansregia, XP_018818635.1)和榴蓮DzCIPK7 (Duriozibethinus, XP_022761105.1)蛋白的氨基酸序列，并與藜麥CqCIPK7蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，序列一致性分別為89.04%、82.57%、54.14%、54.25%、55.65%、51.78%、58.07%、55.62%、50.34%和55.00%，表現(xiàn)出不同的同源性。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，藜麥CqCIPK7蛋白與同科植物菠菜SoCIPK7蛋白和甜菜BvCIPK7蛋白處于同一分支，同源性最高，親緣關(guān)系最近。而CqCIPK7蛋白與其他植物CIPK7蛋白的進(jìn)化距離較長，處于不同分支，遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 CqCIPK7基因組織特異性表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果表明，CqCIPK7基因在藜麥種子、根、莖、葉、花序中均有表達(dá)，但具有明顯的組織表達(dá)特異性。在根中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織，其次是莖和花序，在葉和種子中表達(dá)量最低，分別約為根的0.5倍和0.4倍。

2.4 CqCIPK7基因在鹽脅迫下的表達(dá)

鹽脅迫對(duì)CqCIPK7基因表達(dá)產(chǎn)生一定的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)量隨著鹽脅迫時(shí)間的延長而逐漸增加，呈上調(diào)表達(dá)模式，處理6 h與對(duì)照之間表達(dá)量差異不顯著，處理12 h和24 h的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。說明CqCIPK7基因可能參與了鹽脅迫響應(yīng)過程。

3 討 論

植物經(jīng)過長期的進(jìn)化歷程，形成了一系列復(fù)雜且高度協(xié)調(diào)的信號(hào)途徑，以應(yīng)對(duì)不利的生長環(huán)境。鈣信號(hào)參與多種植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Ca2+在植物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用已被證實(shí)[35-38]。CBL-CIPK蛋白在Ca2+信號(hào)通路中起重要的調(diào)控作用，影響植物生長發(fā)育，并參與生物和非生物脅迫響應(yīng)[1]。目前，已在擬南芥[39]、水稻[1]、玉米[18,31]、甘蔗[20]和油菜[40]等作物中對(duì)CBL和CIPK進(jìn)行了鑒定和功能驗(yàn)證，但關(guān)于藜麥CBL和CIPK的研究至今還沒有報(bào)道。本研究從藜麥中克隆到一個(gè)蛋白激酶基因，命名CqCIPK7。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，CqCIPK7蛋白屬于親水性不穩(wěn)定堿性蛋白質(zhì)，也是一種非分泌型蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量5.13×104，理論等電點(diǎn)9.33；該蛋白質(zhì)包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即N末端S_TKc激酶結(jié)構(gòu)域和C末端NAF調(diào)控結(jié)構(gòu)域，與前人在玉米[3]、二穗短柄草[30]、小麥[2]、茄子[41]等作物上的研究結(jié)果一致。CqCIPK7蛋白定位于葉綠體基質(zhì)(概率91.8%)、葉綠體類囊體膜(70.4%)和葉綠體類囊體空間(67.1%)，而擬南芥AtCIPK1定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核，這種差異可能與CIPK互作的CBL有關(guān)[42]。CqCIPK7蛋白與親緣關(guān)系較近物種(如菠菜和甜菜)相應(yīng)蛋白質(zhì)的同源性在80%以上，而與親緣關(guān)系較遠(yuǎn)物種相應(yīng)蛋白質(zhì)的同源性只有50%左右，說明不同物種間CIPK7蛋白的保守性一般。

CIPK基因的表達(dá)受植物發(fā)育時(shí)期和取樣部位的不同而呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。油菜BnCIPK9在葉片中表達(dá)量最高，其次是莖，在角果皮、花和芽中表達(dá)量較低，在種子和根中幾乎不表達(dá)[43]。擬南芥AtCIPK25在花中表達(dá)量最高，其次是根和莖，在葉片中表達(dá)量最低[44]。本研究結(jié)果表明藜麥CqCIPK7基因具有明顯的組織表達(dá)特異性，在根中表達(dá)量最高，其次是莖和花序，在葉片和種子中表達(dá)量最低，推測(cè)該基因可能參與了藜麥根系的生長發(fā)育過程。

CIPK是植物非生物脅迫信號(hào)通路的重要組成部分，在響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。將油菜BnCIPK6基因轉(zhuǎn)入擬南芥增強(qiáng)了其耐鹽性、耐低鉀性及對(duì)ABA的敏感性[45]。SlCIPK24的過量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因番茄植株的耐鹽性[46]。GhCIPK6的過表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鹽、干旱和ABA脅迫的耐受性[47]。本研究結(jié)果表明，CqCIPK7受鹽脅迫誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)，其表達(dá)量在鹽脅迫處理24 h內(nèi)處于持續(xù)上升狀態(tài)，并且在12 h時(shí)就已經(jīng)顯著高于對(duì)照。因此，推測(cè)CqCIPK7基因可能在藜麥耐鹽脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，但關(guān)于其功能驗(yàn)證及調(diào)控機(jī)理解析有待于進(jìn)一步研究。